Женские окрашивания волос, которые вышли из моды в 2020. И их альтернативы
Наравне с антитрендами 2020 в одежде, стилисты определили список бьюти-запретов. И если какие-то из них мы и не думали пробовать, то некоторые — стали неожиданностью. Стилист Юлия Юдина объяснила, что к чему.
1. Мелирование
Техника мелирования канула в лету: «полоски на арбузе» всем надоели. Когда-то мы считали, что такой прием освежает и придает больше объема. Время не стоит на месте: крупные пряди разных цветов и игра на контрастах теперь не кажутся чем-то трендовым.
Традиционное мелирование можно заменить на современные техники окрашивания. Например, бэбилайтс, в котором мелкие пряди волос окрашиваются на два-три тона, и создается естественный эффект солнечных бликов.
2. Контрастное окрашивание
Черный низ, белый верх или наоборот: это не про школьную форму или дресс-код. Контрастные окрашивания в виде шапочки или гриба, кажется, перепробовали все. Пришла пора с ними проститься.
Резкий переход от темного к светлому смотрится странно и безвкусно. Но естественное амбре никто не отменял: можно высветлить концы и сделать мягкий переход к корням волос. Не ограничивайтесь только одной техникой. Вспомните про балаяж и аиртач.
Читайте также: 10 бьюти-приемов, чтобы тонкие волосы казались густыми
3. Пепельные оттенки
Цвет алюминиевой кастрюльки хорошо сливается с сединой и не доставляет неудобств при окрашивании, но вместе с тем сильно старит. Скоро весна, все хотят свежести и красок: персиковые оттенки, нейтральный или пшеничный блонд сделают лицо отдохнувшим и подчеркнут женственность.
Минус серых стальных оттенков еще и в том, что цвет вымывается быстро, поэтому у обладательниц «металлических» локонов под рукой всегда должен быть фиолетовый шампунь.
4. Кислотные оттенки
Цвета «вырви глаз», как у Билли Айлиш, отлично смотрятся на сцене или имеют место быть в образе, который гармонирует с креативной профессией или неординарным стилем. Если ни того ни другого нет, отдайте предпочтение натуральным оттенкам.
Если все же захотите попробовать неоновое окрашивание, помните, что оно должно быть грамотное. Нет ничего хуже «грязи» на волосах и эффекта «ожидание-реальность».
Мы благодарим за помощь в подготовке материале стилиста, парикмахера Юлию Юдину.
Градиентное окрашивание волос: растягивая цвет и удовольствие
Столько новых слов появилось за последние пару лет в лексиконе столичных модниц: «омбре», «сомбре», «шатуш», «балаяж», «деграде»! Звучит как заклинание красоты или, как минимум, как неуверенные попытки школьника освоить французский за две минуты. На самом деле все упомянутые слова – названия супермодных техник окрашивания волос, совмещающих в себе приемы мелирования и «растяжки цвета».
Изначально с помощью градиентного окрашивания пытались придать волосам объемный и естественный вид. Ведь натуральные волосы часто подвергаются воздействию солнышка, на голове появляются блики и выгоревшие пряди. Особенно это заметно у блондинок и русых, избегающих красок и предпочитающих природную красоту.
Однако, после тридцати лет стилисты советуют всем дамам прибегать к окрашиванию или же перманентному тонированию – собственные волосы тускнеют из-за агрессии внешней среды, смотрятся серо и уныло. На помощь приходит техника сомбре – создание «настоящих» бликов в волосах. Благодаря частичному высветлению прядей, прически темноволосых девушек смотрятся максимально натурально.
Омбре – более радикальная градация цвета. Корни глубокие, темные, насыщенные, кончики – светлые, яркие. Сам переход плавный, растянутый, но при этом контрастный.
Благодаря данной технике вокруг лица появляется своеобразная рамка, которая очерчивает его черты и делает их выразительнее. Вариантов много: одни переходят из каштанового в блонд, а более смелые – из черного в красный или даже розовый.
Техника шатуш подразумевает скорее не осветление, а грамотное, деликатное колорирование. Мастер берет в руку три-четыре очень близких оттенка и устраивает игру красок на вашей голове. Волосы выглядят свежими, живыми и объемными, но даже при близком рассмотрении непонятно – натуральные они или окрашенные.
Его подвид – калифорнийское мелирование – по сути считается той же самой техникой, только оттенки берутся чуть контрастнее (как правило, блонд). Яркий пример – светлая голова Дженнифер Энистон. Его противовес – «шоколадное мелирование», когда на темных волосах проявляются коричневые и карамельные оттенки.
Балаяж – не менее интересный вид градиентного окрашивания, когда стилист наносит краску горизонтальными штрихами, будто рисуя картину.
Прическа выглядит объемно и динамично, кажется чуть «выгоревшей» на солнце, но переход цвета фактически незаметен. Это один из самых натуральных вариантов, с ним удобно отращивать собственный цвет волос – подкрашивать корни не приходится.
Результаты окрашиваний из серии «деграде» и освежающего мелирования внешне очень близки. Только опытный мастер может понять, какая именно техника использовалась на той или иной дамской головке. И чтобы выбрать тот вид, который подойдет именно вам, стоит проконсультироваться с парикмахером-профи и сделать градиентное окрашивание в салоне.
Разглядывая героинь красных дорожек, мы часто удивляемся, как их волосы умудряются выглядеть так натурально, ярко и шикарно. И забываем, что над их прическами трудится круглосуточная бригада стилистов. Иногда то, что выглядит максимально естественно, – это всего лишь грамотно подготовленная, качественная, искусная имитация природной красоты. Все эти техники – давно не секрет, и добиться по-голливудски роскошной шевелюры сегодня может каждая!
10 красивых идей, которые стоит попробовать
В начале 2021 года в Корее стало популярным двухцветное или скрытое окрашивание. Сейчас этот тренд подхватили и другие страны. Посмотрим на этот невероятный корейский стиль?
Что представляет собой корейское двухцветное окрашивание? Оно подразумевает выделение нижней части волос цветом, когда как верхняя остается нетронутой. Если у вас темный цвет волос, то скрытое окрашивание в нижней части можно сделать цветным или использовать блонд.
pinterest.comТакое контрастное окрашивание здорово выделяет стрижку, поэтому перед тем, как окрасить нижние пряди, сделайте стрижку или просто подровняйте концы. Так краска ляжет лучше. Чтобы окрашивание получилось четким, следует отделить верхнюю часть волос буквально ювелирно, с помощью специальной расчески. Если ваши волосы темные, то сначала нижнюю часть следует осветлить, а потом затонировать в нужный оттенок.
Прямой боб с челкой – идеальная база для создания двухцветного скрытого окрашивания. Этот темно-шоколадный оттенок эспрессо идеально сочетается с песочным блондом. В распущенном виде светлой части волос практически не видно, зато при собранной укладке получается настоящее волшебство.
pinterest.comКоричневый или каштановый будет хорошо смотреться на контрасте с прохладным бежевым блондом. При этом окрашивание будет выглядеть вполне естественным, хоть и креативным.
pinterest.comКлассическое каре на густых волосах и скрытое окрашивание с мягким пепельно-песочным блондом. Этот цвет не контрастный, но отлично дополняет собственный темный оттенок. Смотрится интересно и стильно!
pinterest.comЕсли у вас светлые волосы, то скрытое окрашивание можно сделать цветным или темным. Посмотрите как замечательно смотрится блонд с пастельным фиолетово-синим – ярко, но не кислотно.
pinterest.comНижние пряди можно окрасить не полностью, взять лишь несколько волосков, осветлить их и затонировать. Получится тонкое скрытое мелирование, которое, перемешиваясь, будет красиво сочетаться с натуральными волосами.
pinterest.comЧерный и синий – тоже классное сочетание, которое выглядит не совсем контрастно, но оригинально. Это окрашивание придаст вам характерный стиль, готовы к всеобщему вниманию?
pinterest.comТемный оттенок эспрессо и мягкий пепельно-розовый оттенок. На средней длине волос такое окрашивание смотрится красиво и стильно. Интересно будет выглядеть такой цвет в хвосте, если собрать его не высоко и не низко.
pinterest.comТемный сиреневый тоже лидер среди цветных оттенков для волос. Одинаково хорошо смотрится и с темными, и со светлыми волосами. В последнем случае окрашивание будет более контрастным.
Классическое сочетание – черный плюс песочный блонд. С любой прической такое окрашивание будет смотреться потрясающе. Словно героиня из аниме, согласитесь?
pinterest.comДвухцветное скрытое окрашивание можно сделать на любых волосах – прямых, вьющихся, тонких, редких или густых. Но не повторяйте этот трюк самостоятельно, лучше довериться мастеру.
Как вам такой тренд в окрашивании? Хотели бы попробовать?
Читайте нас в Яндекс Дзен LADYLINE.ME и Сам Себе Парикмахер
самые популярные и современные виды окрашивания волос
Новый цвет волос — новая жизнь. Именно с такими мыслями отправляется в салоны красоты большинство девушек. С каждым годом появляется все больше видов окрашивания, среди которых любая выберет то, что обыграет ее внешность. Представляем вашему вниманию самые популярные и современные виды окрашивания, которые помогут освежить внешность либо кардинально сменить имидж.
Классическое окрашивание
Пожалуй, нет более простого вида окрашивания, чем классическое. Оно предполагает использование краски одного цвета, а также ее равномерное нанесение на волосы. Преимуществом этой техники является то, что для ее осуществления не нужно проделывать сложных манипуляций, важно лишь подобрать необходимый и подходящий внешности оттенок. При этом в моде сейчас как натуральные цвета, так и яркие и необычные.
Мелирование
Этот вид окрашивания предполагает осветление отдельных прядей. Их толщина и оттенок могут быть любыми. Сложность мелирования состоит в том, что выполнить его самостоятельно без определенной подготовки аккуратно не удастся. Чтобы его сделать понадобится специальная шапочка с равномерными отверстиями или фольга, в которую будут заворачиваться прокрашенные пряди. Основными преимуществами является то, что эта техника подойдет для тех, кто не готов к существенным переменам, а также то, что на волосах получатся красивые блики, которые придают образу свежесть.
Колорирование
Это сложная техника окрашивания волос, предполагающая использование до 10 оттенков, которые наносятся на отдельные пряди. Здесь можно добиться двух эффектов: плавного или контрастного перехода. Обладательницам светлых волос можно смело экспериментировать с каштановыми, русыми и рыжими оттенками, шатенкам — со светлыми и темными, брюнеткам — с красными и русыми.
Мажимеш
Обладательницам тонких и ослабленных волос, которым традиционное окрашивание может нанести вред, подойдет техника под названием «мажимеш». Ее особенность заключается в деликатном осветлении до 4 тонов. Для этого используется специальная краска, которая в своем составе имеет воск. Благодаря этому можно получить мягкие и золотистые переходы. Стоит заметить, что этот способ никак не подойдет обладательницам темных волос.
Омбре
Популярность этой техники не утихает. В ней важно сделать плавный горизонтальный переход от одного цвета к другому. Таким образом, волосы у корней будут самыми темными, а кончики — светлыми. Такое окрашивание в какой-то степени можно отнести к щадящим, так как чаще всего на корни не наносят красящий состав, но все же основная нагрузка приходится на середину длины и сами концы.
Пиксельное окрашивание
Такое окрашивание безусловно понравится смелым натурам, жаждущим экспериментов. Но выполнять его лучше у опытного мастера. Итак, сущность этого способа заключается в последовательном нанесении краски разных цветов, в результате чего на волосах должен получиться геометрический рисунок в виде пикселей. Но чтобы продемонстрировать полученную композицию, необходимо чтобы волосы были идеально ровные и имели форму.
Градиентное окрашивание
Это способ окрашивания, для которого используется два тона, и между ними делается растяжка цвета. Здесь можно добиться как горизонтального, так и вертикального перехода. Для этого можно сделать классический градиент — от темного к светлому, так и необычный — от темного или светлого к яркому. К тому же, этот способ подойдет девушкам с абсолютно любым исходным цветом волос, но нюансом может быть длина. Так, обладательницам короткой стрижки лучше подобрать себе что-то другое.
Тонирование
Это безвредная процедура для волос, направленная на незначительное изменение цвета — до 3 тонов. За счет своего очень мягкого состава краска не способна проникнуть вглубь волоса, поэтому пигмент остается на прядях недолго, примерно до двух месяцев. Причем он смывается постепенно и равномерно. Тонирование можно осуществить в домашних условиях, ведь сделать его совсем не сложно, но все равно нужно учитывать некоторые нюансы. Важно придерживаться инструкции, которая предоставляется к тонирующему средству — тонику, шампуню, пене.
Шатуш
Это наиболее приближенный к естественности вид окрашивания. Так называемое французское мелирование позволяет добиться эффекта выгоревших волос под южным солнцем. Для этого необходимо осветлить отдельные пряди на пару тонов и сделать мягкие и плавные переходы от корней к длине и кончикам за счет тщательной растушевки цвета. Таким образом, можно заметить визуальный объем и дополнительную густоту.
Балаяж
Это окрашивание сочетает в себе две техники — мелирование и колорирование. Здесь мастер учитывает длину волос, стрижку, а также цветотип девушки. Для этого способа используют краски в нескольких оттенках, которые наносятся в хаотичном порядке на середину длины и кончики. Таким образом, должен получиться очень плавный переход без видимых границ. Обладательницы балаяжа могут подолгу не обращаться к парикмахеру, так как создается модный эффект отросших и выгоревших прядей, не требующих постоянного обновления цвета.
Брондирование
Это сложный вариант окрашивания, который могут выполнить руки опытного колориста. Итак, сущность брондирования заключается в подборе максимально приближенных друг к другу 3-4 оттенков в натуральной гамме. Это могут быть ореховые, шоколадные, медовые, бежевые цвета. За счет мягких переходов создается эффект густых и объемных волос, которые слегка выгорели на солнце.
Если вы желаете, чтобы выбранный вид окрашивания идеально подходил к вашему образу, обращайтесь только к опытным специалистам и забудьте о том, чтобы экспериментировать самостоятельно в домашних условиях. В салоне красоты Image House ONLY YOU работают специалисты высшего класса, которые помогут вам сменить стиль или просто освежить внешность, подобрав для вас необходимый вид окрашивания, исходя из индивидуальных особенностей вашего облика и личных предпочтений.
Читайте также:
Тенденции в окрашивании волос 2017 – PORUSSKI.me
Мода на окрашивание волос очень изменчива. Сложно выделить одно направление. Сегодня представлено огромное количество оттенков, полутонов, техник окрашивания и формирования текстуры волос. Среди такого многообразия становится еще сложнее выбрать подходящие цвета и оттенки, свою степень контрастности, которая подчеркнет индивидуальный стиль и характер, а также будет гармонична с внутренним миром и настроением.
Главным трендом в окрашивании волос в этом году по-прежнему является естественность. В модной цветовой палитре 2017 года присутствуют практически все натуральные оттенки: теплые – песочный, золотистый, карамельный, капучино, мягкий бежевый; холодные – пепельный блонд, латунный, серебристый. Не выходят из моды и все оттенки естественного рыжего и коричневого. Особой популярностью среди модниц пользуются прохладные русые оттенки волос.
Однако есть цвета, которые в этом году вовсе пропали из модной палитры, – это иссиня-чёрный цвет и неестественно яркий блонд.
Помимо разнообразия оттенков придется задуматься и о выборе техники окрашивания. Моя рекомендация: добавлять в основной цвет блики и слегка менять оттенок цвета к кончикам. Обязательное условие – оттенки должны быть родственными, чтобы окрашивание выглядело натурально, а волосы – ухоженно.
Для девушек, желающих сделать образ более ярким и эффектным, я советую более контрастный переход от корней к концам волос.
Давайте разберемся в основных направлениях техник окрашивания. Я часто сталкиваюсь с тем, что клиенты не могут объяснить, чего точно хотят. Поэтому, когда вы впервые собираетесь к стилисту, принесите несколько фото желаемого результата, ведь при объяснениях терминами может произойти недопонимание с мастером.
Если же вы уверены в своём парикмахере, то лучше просто ему довериться, высказав основные пожелания.
Вот самые популярные техники окрашивания на сегодняшний день:
Калифорнийское мелированиеДобавление в цвет прядей светлее на тон-два, но в том же оттенке, мягко растушеванных у корней волос. Свое название эта техника получила благодаря эффекту выгоревших волос под жарким калифорнийским солнцем. Такой вариант будет смотреться привлекательно на любых оттенках волос – светлых, тёмных, рыжих.
ОмбреКонтрастное окрашивание с плавным переходом от тёмного цвета к светлому. Подходит такое окрашивание абсолютно всем, независимо от возраста, стрижки и длины волос.
БалаяжМягкое окрашивание в технике “свободной руки”.
Стилист, подобно художнику, создает на волосах блики и плавные переходы от одного тона к другому.
Техника, близкая к окрашиванию балаяж: для неё также характерны мягкие переходы. Это словно переливы и блики на волосах. Один из вариантов естественного окрашивания.
БрондированиеЭто более сложное в технике исполнения окрашивание. Такая техника помогает создать зрительный объём волос за счёт переходов из 3-4 оттенков, которые гармонично сочетаются между собой.
Мои советы девушкам, которые носят один из видов модных окрашиваний: при окрашивании ваши волосы подвергаются осветлению, что портит их структуру и делает более уязвимыми. Поэтому не забывайте о качественном профессиональном уходе!
Так как отрастает натуральное окрашивание очень мягко, вы можете позволить себе осветлять новые блики лишь раз в 4-6 месяцев. При этом не забывайте чередовать с процедурой осветления обычное тонирование безаммиачной краской-уходом. Тонирование разглаживает волосы, придаёт им благородный оттенок и блеск, а также наполняет их структуру и делает их более крепкими. Соблюдая эти нехитрые рекомендации, вы сможете всегда выглядеть актуально и стильно.
Следую тенденциям этого сезона, вы можете примерить новый цвет или технику окрашивания, не изменяя своему естественному образу. Вам не придется кардинально менять имидж, гардероб или манеру макияжа. Важно лишь расставить акценты в образе. На мой взгляд, это отличная возможность попробовать что-то новое и актуальное.
Елизавета Святец
Основатель и премиум стилист студии стилистов “T&L Studio”
Опыт работы в качестве парикмахера более 8 лет. Неоднократный участник и победитель профессиональных конкурсов. Творческий партнер компании GOLDWELL.
vk.com/id139432183 / elizaveta_svyatetc
Автор онлайн-журнала Porusski.me Все самое интересное: путешествия, красота и мода, еда, дизайн, свадьбы, главные события, интересные фотосессии и многое другое!
Цветное окрашивание кончиков волос в яркие цвета (видео)
Многие женщины хотели бы несколько разнообразить свой образ, однако далеко не все из них готовы пойти на кардинальные перемены.
Рассмотрим как провести окрашивание кончиков волос в яркие цвета и оттенки, больше о цветной покраске концов русых волос с фото и видео, как сделать в домашних условиях.
Какие современные техники этой покраски существуют и чем они отличаются, обо всем этом и многом другом вы узнаете в нашей статье.
В настоящее время наибольшей популярностью пользуются три типа процедур, в результате которых происходит покраска кончиков волос. Данные разновидности отличаются, во-первых, техникой исполнения, а во-вторых, эффектом, оказываемым в конечном итоге. Две из них имеют выраженную повседневную направленность, третья же может быть использована для особого акцентирования внимания на своей персоне за счет невероятной яркости.
Следует отметить, что покраска концов волос в другой цвет сейчас особенно популярна, поскольку позволяет сделать образ интереснее, но при этом не требует делать какой-либо смелый шаг в этом направлении. Вы оставляете свой обычный цвет волос, который начинает выглядеть совершенно иначе из-за того, что визуально соседствует с новым оттенком на их концах.
Специалисты не рекомендуют проводить окрашивание кончиков волос в домашних условиях, поскольку эта процедура достаточно сложна в исполнении и требует определенного опыта. Неправильные действия способны испортить конечный результат и даже навредить здоровью волосяного покрова. Именно поэтому если вы все-таки решили краситься самостоятельно, предварительно следует ознакомиться с подробным описанием того, как производится окрашивание кончиков волос. Видео-инструкции также могут вам помочь в этом.
Эта самая популярная на сегодняшний день покраска кончиков волос, как называется такая техника вы, наверное, уже слышали и не раз – «омбре». Суть ее заключается в том, что всего используются два оттенка: собственный более темный и светлый. Основная особенность такой процедуры заключается в плавном переходе одного оттенка в другой, благодаря этому сохраняется естественность цвета, но при этом создается еще и довольно сильный акцент на волосах.
Чаще всего эту технику применяют при окрашивании брюнеток с шоколадным или каштановым цветом, но подойдет метод «омбре» и как покраска кончиков русых волос. Главное условие здесь – гармоничное сочетание оттенков, которое бы не нарушило общей натуральности.
Сама покраска кончиков волос в светлый цвет производится в несколько этапов, на каждом из которых смесь наносится на определенный участок прядей. Сначала это кончики, затем средняя часть и в конце – область корней. После нанесения вещества пряди заматывают в фольгу и выдерживают определенное время. Наибольшая выдержка применяется к концам волос, а наименьшая – к корням. Благодаря этому сохраняется постепенная смена оттенка от светлого к темному.
Как уже ясно из названия, главная особенность этой процедуры заключается в контрастном сочетании темных и светлых оттенков. Как называется окрашивание кончиков волос по такой технике вы также, наверное, уже слышали – это французское слово «балаяж».
Если вспомнить предыдущий метод, то главной задачей при его исполнении было создать очень мягкий переход между оттенками. Данное же окрашивание волос темные корни, светлые концы и границу между ними максимально противопоставляет друг другу. Конечно, граница между оттенками немного смягчается, но ни о каком переходящем оттенке, растянутом на половину длины волос здесь речи не идет.
Сама процедура, по которой проводится окраска кончиков волос, имеет несколько упрощенный характер. На концы прядей наносится красящий состав и заворачивается в фольгу. После этого выжидается определенное время и вся смесь смывается. Главная сложность в исполнении этой покраски заключается как раз в правильно сделанной границе между оттенками, поскольку непрофессиональное выполнение чревато получением слишком резкого эффекта.
Молодежь и даже люди среднего поколения в последнее время все чаще стали применять цветное окрашивание кончиков волос. В большинстве случаев такая процедура имеет временный характер и выполняется при помощи специальной пастели. Те же модницы, которые хотят закрепить результат на относительно долгий срок используют яркие краски, благо, в настоящий момент косметический рынок предлагает их в изобилии.
Покраска кончиков волос в яркие цвета при помощи пастели отличается невероятной простотой и универсальностью. Дело в том, что такие краски отлично смываются шампунем, а использовать их можно несколько раз в неделю. Это означает, что смена образа не займет много времени и практически никак не привязана к здоровью волосяного покрова.
Когда же мы говорим о полноценном окрашивании при помощи специализированных средств, то здесь частота проведения процедур значительно снижается. Однако нельзя забывать, что подобные краски оказывают довольно щадящее воздействие и не проникают слишком глубоко в волос. Обычно оттенок теряет свой изначальный тон уже спустя неделю.
Профессиональные стилисты рекомендуют использовать цвета с содержанием холодного синего и зеленого, а также насыщенного фиолетового, если вы брюнетка и вам понравилась подобная окраска кончиков волос. На светлые волосы же лучше наносить теплые оттенки красного и розового.
Если вы очень хотите провести данную процедуру дома, то вам поможет данное описание техники, по которой проходит окраска кончиков волос: на темные волосы наносится девяти процентный раствор окислителя, для светлых хватит и трех процентов. После этого следует выждать время, указанное в инструкции продукта. Затем на то место, где ранее находился раствор, наносится краска, и пряди оборачивают фольгой. После небольшого промежутка времени голову моют с шампунем. Без использования окислителя итоговый цвет, который вы должны были получить, проведя окрашивание кончиков волос, не будет столь ярким или, возможно, не закрепится вовсе.
Как покрасить концы волос (видео)
Похожие записи
Контрастное окрашивание — Справочник химика 21
ВИРИРОВАНИЕ ФОТОГРАФИЧЕСКОЕ (тонирование) — превращение черно-белого серебряного изображения в окрашенное с художественной целью или для увеличения плотности и контрастности изображения. В. ф. осуществляют превращением серебра в окрашенное соединение заменой серебра другим металлом, осаждением на серебре соединений другого металла, окрашиванием серебра красителем, изменением дисперсности серебра. Для осуществления В. ф. изображение сначала отбеливают раствором окислителя и галогенида щелочного металла. Образовавшийся галогенид серебра обрабатывают растворами сульфидов для окрашивания изображения в желто-коричневый цвет заменяют серебро золотом, платиной, ураном, свинцом, ванадием и др. Цветовой оттенок зависит от дисперсности серебра, температуры тонирующего раствора, продолжительности обработки. [c.54]Контрастное окрашивание красителями относится к числу неспецифических реакций этот метод обнаружения также может оказаться очень полезным. [c.96]
Сравнительная оценка модификации с применением фазово-контрастной микроскопии и метода А. С. Разумова при определении общего числа микроорганизмов в одних и тех же пробах воды Горьковского водохранилища показала довольно близкие результаты. Однако общее число бактерий, определяемое методом фазовоконтрастной микроскопии, выше (в среднем на 15%), чем полученное прямым счетом с окрашиванием. [c.85]
Контрастность изображения повышается при работе без пленки-подложки, т, е. при нанесении материала непосредственно на сетку. Усиливается контрастность отдельных фаз и при искусственном их окрашивании путем введения в объект частичек некоторых металлов, дающих иное рассеяние электронов, чем сама фаза. [c.134]
Для выявления структуры меди, латуни, оловянистой бронзы, монель-металла. Этот реактив также дает различное окрашивание зерен феррита в стали Для выявления структуры латуни и бронз. Иногда для получения более контрастной структуры после травления в этом реактиве применяется травление в реактиве № 9. Это особенно целесообразно для алюминиевой бронзы. Применяется в свежеприготовленном виде [c.48]
Фон поверхности — окрашивание проявителя при проявлении контрастного пенетранта или свечение проявителя при проявлении люминесцентного пенетранта, вызванное микрорельефом бездефектной поверхности объекта контроля. [c.571]
Фильтрацию воды через мембранный фильтр проводят без фильтровального прибора. Необходимый объем воды при помощи пипетки постепенно и равномерно наносят на поверхность мембранного фильтра, помещенного в чашку Петри на подкладку из нескольких слоев стерильной фильтровальной бумаги, которая впитывает воду, прошедшую через мембранный фильтр. Мембранный фильтр затем пинцетом перекладывают на чашки Петри с питательным агаром с 0,0005% ТТХ. ТТХ вводят в расплавленный агар перед его использованием. Колонии на мембранных фильтрах выращивают при 37°С в течение 24 ч. ТТХ в питательном агаре выполняет роль красителя для окрашивания колоний и получения достаточной контрастности, что облегчает и ускоряет подсчет. Для большей точности результатов счет колоний целесообразно проводить с помощью стереоскопического микроскопа. [c.73]
Дальнейшие модификации метода прямого счета микроорганизмов по Разумову касались усовершенствования этапа окрашивания микроорганизмов с целью сокращения времени анализа, получения большей контрастно- [c.82]
Биологические материалы отличаются высокой акустической контрастностью без использования каких-либо -методов окрашивания. С помощью сканирующей акустической микроскопии исследовали живые красные кровяные клетки и фибробласты цыпленка [86]. Этот хорошо разработанный метод, очевидно, можно успешно применять и во многих не менее интересных приложениях. [c.452]
Применение. В электронной микроскопии для дополнительного окрашивания с целью увеличения контрастности исследуемых объектов [1]. В аналитической химии для количественного определения иода в присутствии хлора и для микрохимического анализа галогенидов и многих металлов, например, Аи, Pt, U, Th. [c.378]
Окрашивание по Граму. Клеточная стенка, по-видимому, ответственна также за окрашивание по Граму. Способность или, наоборот, неспособность окрашиваться в темно-фиолетовый цвет при использовании метода, предложенного в 1884 г. Грамом, служит важным таксономическим признаком, с которым коррелируют другие свойства бактерий. Процедура окрашивания по Граму начинается с обработки фиксированных бактериальных клеток основным красителем кристаллическим фиолетовым. Затем следует обработка раствором иода. Иод образует с кристаллическим фиолетовым комплекс, нерастворимый в воде и плохо растворимый в спирте и ацетоне. После этого клетки дифференцируют , обрабатывая их спиртом грам-положительные клетки удерживают при этом комплекс краситель—иод и остаются синими, а грам-отрицательные обесцвечиваются. Для того чтобы сделать их видимыми, их дополнительно окрашивают контрастным красителем фуксином. [c.50]
В определенных случаях может рассматриваться как селективная реакция иона А1 + с алюминоном. К крупинке пробы, содержащей алюминий, добавляют крупинку хлорида аммония и столько же порошка алюминона. Тщательно растирают и смачивают смесь каплей воды. В присутствии алюминия появляется розово-красное окрашивание, если его нет, продукт окрашен в коричнево-красный цвет. Более контрастна реакция при замене хлорида аммония на карбонат. Пробы, содержащие железо, предварительно следует разложить нагреванием с сернокислым аммонием. Охлажденную массу смешивают с винной или лимонной кислотой, добавляют равное количество карбоната аммония, энергично растирают, прибавляют алюминон и продолжают растирание. Через некоторое время в присутствии алюминия появляется вишнево-красное окрашивание. При увлажнении реакционной массы дыханием и легком нагревании окраска появляется скорее. [c.124]
Окрашивание облученного полиэтилена, так же как и обычного, наряду с приданием изделиям хорошего внешнего вида преследует во многих случаях сугубо технические цели. Одновременно с решением эстетических задач обеспечивается необходимая маркировка, контрастность, маскировка, имитация. Обширная номенклатура красителей, рекомендуемых для окрашивания полиэтилена, приведена в ГОСТ 16338—70 и ГОСТ 16337—70. Сведения об окрашивании полиэтилена содержатся в работах [358—361]. В работе [362] обобщены результаты радиационных испытаний некоторых органических красителей и неорганических пигментов. Отсутствие у полиэтилена сродства ко многим красителям затрудняет их окрашивание. Основным способом окрашивания является механическое введение красителей и пигментов в состав композиций. Предложены методы окрашивания полиэтилена, основанные на химическом взаимодействии красителей со специально вводимыми в полиэтилен компонентами. Окрашивание может быть осуществлено введением в полиэтилен ионов металлов (никеля, хрома, кобальта, магния, марганца, железа, ванадия, меди, алюминия, цинка, стронция), способных к образованию комплексов с азокрасителями [363—367]. В этом случае используются, как правило, галогениды, сульфаты, оксалаты, фосфаты, бензоаты, салицилаты, цианиды, ацетаты, цитраты, стеараты металлов и др. [c.128]
Фиксированные по Боуэну препараты лучше всего окрашиваются разведенными растворами основных красителей. Подходят для этого 0,01%-ные растворы кристаллического фиолетового, тионина или метиленового синего, которыми прокрашивают в течение 1—5 мин. Точное время окрашивания определяют в предварительных экспериментах. Для окрашивания цитоплазматических включений могут применяться другие красители (разд. 3.3.11). Основные красители прокрашивают богатую рибосомами цитоплазму преимущественно в хорошо сохранившихся, фиксированных по Боуэну клетках нуклеоплазма не окрашивается, она негативно выявляется точно так же, как и при фазово-контрастной микроскопии живых клеток. Описанный способ фиксации не годится для окраски нуклеоплазмы по Гимзе, даже после обработки рибонуклеазой или кислотного гидролиза. [c.49]
Первичная (собственная) люминесценция наблюдается без предварительного окрашивания объекта, вторичная (наведенная) возникает после окраски препаратов специальными люминесцирующими красителями—флюорохрома-м и. Люминесцентная микроскопия по сравнению с обычными методами обладает радом преимуществ возможностью исследования живых микроорганизмов и обнаружения их в исследуемом материале в небольших концентрациях вследствие высокой степени контрастности. [c.15]
Описаны приемы локализации протеолитической активности после электрофореза в крахмальном [655, 1120] и полиакриламидном гелях [57] с использованием методики включения субстрата в гель. Возможность применения этой методики для указанной цели была недавно изучена [37]. Чтобы предотвратить миграцию белкового субстрата вовремя электрофореза, эти авторы использовали в качестве субстрата казеин, осажденный кислотой. Нерастворимый казеин обрабатывали ультразвуком и образовавшиеся мельчайшие частицы смешивали с гелеобразующим раствором. Конечная концентрация казеина в геле составляла 0,1% (масса/объем). После электрофореза гель инкубировали в течение 2—12 ч при 37°С в 0,1 М буфере трис-НС1 (pH 7,5). Казеин пригоден только при электрофорезе в кислой среде, поскольку в щелочной среде он мигрирует. В этом случае вместо казеина можно использовать препарат гемоглобина, приготовленный путем осаждения и обработки ультразвуком. Окрашивание гелей белковым красителем (напри-, мер, нигрозином) увеличивало контрастность полос. [c.303]
Объект можно сделать более контрастным, либо почти до предела закрывая диафрагму конденсора, либо окрашивая клетки, либо применяя фазово-контрастное устройство. Первое нежелательно, так как снижает апертуру конденсора и тем самым заметно уменьшает разрешающую способность микроскопа. Окрашивание препарата дает хорошие результаты, но в большинстве случаев оно осуществляется после фиксации микроорганизмов, что не всегда желательно. Основная ценность метода фазового контраста состоит в том, что он дает возможность наблюдать живые объекты, не прибегая к их фиксации и окрашиванию. Применение фазово-контрастного устройства не позволяет увеличить разрешающую способность микроскопа, но дает возможность увидеть прозрачные объекты более четко и даже выявить некоторые структуры и включения в клетках крупных бактерий. [c.91]
Контрастное окрашивание диффузионных структур на кремнии проводят 49%-ным раствором HF с добавкой 0,1% 70%-ной HNOg. При этом р-область селективно окрашивается вследствие более интенсивного оксидирования. Для этого же пригоден травитель СР-4А (см. работу 12). Толщину диффузионного слоя рассчитывают по формулам h = dsina или h = liga в зависимости от способа наблюдения (см. работу 14). Экспериментально определенную глубину диффузионного слоя сравнивают с теоретически рассчитанной- [c.165]
Контрастное окрашивание слоя. Желтый хииондиазид при экспонировании обесцвечивается (см. рис. II. 1) в местах действия света, но поскольку наряду с перегруппировкой идет и разложение, слой приобретает красноватый оттенок. Однако отличие цвета таких участков слоя от исходного невелико, особенно в желтом свете. При последовательном экспонировании шаблонов (одного или нескольких) на одну пластину из-за плохого цветового контраста возникает брак вследствие неверного совмещения, повторного экспонирования, например при перерывах в работе. Кроме того, готовый резистный слой часто обладает недостаточным контрастом по отношению к подложке, особенно неокрашенной и блестящей. Для придания цветового контраста готовому слою на подложке в композицию вводят 0,2—0,6 % от массы сухих компонентов различных красителей. При проявлении они не должны вымываться из слоя. Для создания контраста сразу после экспонирования необходимо обеспечить изменение цвета красителя в местах действия света. С этой целью вводят красители-иидика-торы, меняющие цвет в области pH 2,5—6,5 [пат. ФРГ 1447011], и вещества, генерирующие кислоту при фотолизе. Уже сама появляющаяся в слое при экспонировании замещенная инденкарбоновая кислота понижает pH системы, однако это понижение pH часто недостаточно для создания цветового контраста. При фотосольволизе галогенангидридов 4-сульфо-2-диазо-1-нафталинона образуется 2 моль сильной кислоты [например, пат. США 3969118 пат. ФРГ 2331377], однако слои с добавкой такого хинондиазида обладают меньшим сроком хранения [c.91]
Наиболее контрастное окрашивание наблюдалось прн добавке этанола. Преаваритель-ное нагревание растворов также улучшало контрастность окраски шкалы палладия. [c.120]
Большинство низших алифатических спиртов представляет собой летучие соединения, которые нельзя хроматографировать непосредственно на бумаге. Поэтому их обычно переводят в производные, например 3,6-динитрофталаты, 3,5-динитробензоаты, Л Л -диметил-л-аминобензолазобензоаты, ксантаты, которые легко поддаются обнаружению (табл. 3.6). Высшие алифатические спирты нелетучи, но обычно настолько липофильны, что их можно хроматографировать только в обращенно-фазных системах. Основная трудность в хроматографии этих соединений — их обнаружение. Для этого пригодны далеко не все реагенты. Высшие алифатические спирты можно обнаружить посредством контрастного окрашивания родамином В (ОР-11) их легко перевести в производные, например аллилуретаны, и обнаруживать в виде производных [64]. [c.101]
Применение ацето- или пропионоорсеина дает очень четкое контрастное окрашивание хромосом на фоне светлой цитоплазмы. Окрашивание цитоплазмы наблюдается лишь в очень редких случаях. [c.187]
На адсорбционном связывании молекул кислых органических красителей на поверхности белковых веществ основано окрашивание последних, чем широко пользуются для качественных и количественных определений при электрофорезе на бумаге. Избыток красителя необходимо вымыть из бумаги, так чтобы окрашенными оставались только белковые вещества следует выдерживать стандартные условия. На адсорбционных явлениях основано, по-видимому, так называемое контрастное окрашивание липоидных веществ, предложенное РСауфманом. [c.168]
Фазовоконтрастная микроскопия используется для повышения контрастности изображения. В световой микроскопии высокая контрастность объекта обусловливается окрашиванием отдельных его составных компонентов (поляризационная окраска и окраска, возникающая в результате травления препарата) и оптическим эффектом на границе раздела фаз, В электронном микроскопе повысить контрастность изображения этими способами возможно. Контрастность изображения в электронном микроскопе определяется степенью различия в рассеянии электронов отдельными составными частями (кристаллами и т. п.) препарата. Частй недостаточная контрастность отдельных фаз объекта не позволяет в полной мере использовать разрешаюш,ую способность электронного микроскопа. [c.134]
Модификация Эрлиха (Ehrli h, 1956). С целью повышения контрастности между бактериями и фильтром последний окрашивают перед фильтряпирй, погружая на 5—10 с в раствор фуксина (0,3 мл насыщенного раствора в 10 мл дистиллированной воды). После фиксации в 95% спирте фильтр отмывают в дистиллированной воде в течение 10—15 мин. Окрашивание бактерий производят 0,01 % раствором предварительно профильтрованного метиленового синего (pH 10), накапывая краску на фильтр на 2—5 мин непосредственно на столике фильтровального аппарата. Краску фильтруют, мембранный фильтр подсушивают 10 мин при 60—70°С. [c.84]Модификация метода прямого подсчета с применением фазово-контрастной микроскопии. А. Г. Кокина (1956), А. С. Разумов, Л. Е, Корш (I962), Ri hards, КгаЬек (1954) использовали фазово-контрастную микроскопию для подсчета общего числа бактерий, предварительно сконцентрированных на мембранном фильтре. После высушивания мембранного фильтра (без окрашивания) готовят препарат и просчитывают бактерии под микроскопом с помощью фазово-контрастного устройства. При подсчете бактерий используют зеленый светофильтр, благодаря которому получается поле зрения спокойного зеленого цвета. Бактерии на зеленом поле выглядят довольно контрастно, как черные точки или палочки различных размеров. [c.85]
П ш е н и ц а и я ч м е и ь. Не у всех злаков различие люминесценции срезов семян в зависимости от их жизнеспособности выражено отчетливо. В таких случаях пользуются другим приемом люминесцентного ана лиза — окраской флуоресцентными красителями. Так, жизнеспособность семян пшеницы, р ки и ячменя определяют после предварительного окрашивания Срезов зародышей флуорохромами, увеличиваюхцимп контрастность свечения зародыша и эндосперма. Для окраски срезов зародышей пшеницы применялся водно-спиртовой раствор родамина 6 ЖДН концентрации 0,00005—0,0001 г/сл , а для окраски срезов ячменя — содовый раствор (1% N33003) акридинового оранжевого концентрации 0,0003- - [c.233]
В электронной микроскопии для окрашивания структур, слабо импрегни-рующихся осмиевой кислотой, а также для усиления контрастности исследуемых [c.423]
В заключение следует упомянуть, что изображения, содержащие участки различного цвета, можно получать на диазотпп-Бых материалах простыми приемами. Например, на экспонированный слой диазосоединения по шаблону наносят щелочные растворы различных азосоставляющих, в результате чего получаются участки изображения, окрашенные в разные цвета [8]. Чрезвычайно широко применяются дпазотипньГе материалы на цветных подложках, что позволяет в сочетании с контрастирующими линиями изображения получать различные цветовые эффекты и значительно увеличить контрастность материала. С другой стороны, окрашенные в яркие тона подложки позволяют маскировать пожелтение фона отпечатков. В большинстве случаев при получении материалов этого типа светочувствительный раствор наносят на бумажную подложку, окрашенную предварительно минеральными пигментами или органическими лаками. Однако в некоторых случаях окрашивание фона можно осуществить в процессе проявления. Для получения, светокопий подобного рода рекомендуется в светочувствительный слой, содержащий диазосоединение и азосоставляющую, вводить вещества, которые при проявлении парами аммиака окрашивают подложку [9]. Образующийся в результате этой реакции краситель не отбеливается даже при интенсивном освещении. Для окрашивания подложки в желтый цвет в слой вводят калиевую соль титанофтористоводородной кислоты, которая взаимодействует с азосоставляющей, например с 2,3-диоксинафталин-б—сульфокислотой, и образует желтый краситель. [c.248]
Первое требование заключается в установлении достаточной контрастности между двумя типами блоков, чтобы можно было нх легко распознать. Это может быть достигнуто окрашиванием одного из блоков полибутадиенового или полиизопренового блока парами тетроксида осмия [17], а поливинилпирндинового блока — нитратом серебра [18]. Поскольку ни один из этих реагентов не окрашивает полистирол, полистирольные блоки появятся на микрофотографиях в виде светлых участков, а другие блоки — в виде темных. Второе требование электронографии состоит в необходимости приготовления достаточно тонких образцов, прозрачных для электронов, т. е. толщиной 100—2000 А. [c.213]
Большинство механических повреждений, таких, как истирание, разрушение от растяжения или трепания, вызывает продольное расш,епле-ние или фибриллирование волокон. Разрушение под действием кислот сопровождается поперечным растрескиванием 1204]. Сравнение образцов оксицеллюлозы, полученных окислением перйодатом, бихроматом и гипо-бромитом, показывает, что для каждого типа окисления имеется характерный рисунок фрагментации, но во всех случаях наблюдается поперечное расщепление микрофибрилл [188]. Оболочку вискозного шелка легко различить на тонких поперечных срезах, используя фазово-контрастную методику, причем не требуется ни окрашивания, ни какой-либо другой, обработки [208]. Анализ можно также провести с помощью водных растворов прямых 1127, 192, 194, 216] и основных красителей [16, 93]. Для этой же цели применяют восстановленное серебро [104, 124] и золото [124, 271]. Дисульфнновый синий VNS ( .I. 42045) различно окрашивает оболочку и сердцевину волокон, содержащих конденсационные смолы [137]. [c.302]
Для лучшего раздавливания объектов рекомендуется обработать их после окраски 5%-ным водным раствором цитазы (фермент пищеварительной железы виноградной улитки используются растертые высушенные зобы). Обычно применение ацетокармина дает возможность получать четко окрашенные хромосомы на фоне слабо окрашенной цитоплазмы. В том случае, если хромосомы красятся плохо, применяют протравливание в железо-аммоний-ных квасцах, в результате чего достигается достаточная степень контрастности в окрашивании хромосом и цитоплазмы. Для этого объект перед окрашиванием помещают на 5—10 минут в 2—4%-ный водный раствор железоаммонийных квасцов, промывают и окрашивают, как описано выше. [c.187]
Фиксация с последующим окрашиванием клеток и тканей— один из наиболее распространенных способов подготовки объектов к исследованию в цитологии и эмбриологии. Под действием химических фиксаторов (этиловый спирт, формалин, уксусная кислота и др.) в клетке прекращаются жизненные процессы, а ее химические компоненты осаждаются. После фиксации объект промывают. Дальнейшая обработка зависит от типа приготовления препарата. Можно окрасить материал сразу для изготовления временного препарата. Для получения тонких срезов толщиной в несколько микрометров объект обезвоживают, заключают в парафин и режут на микротоме. Срезы наклеивают на предметные стекла, освобождают от парафина и окрашивают. Красители подбирают так, чтобы повысить контрастность изображения отдельных структур, а в ряде случаев и выявить их химический состав, например ДНК, РНК, белки и др. Точное содержание химических веществ определяют на приборе — цитофотометре. [c.54]
Методы окрашивания могут быть теми же, что и для препаратов, фиксированных по Боуэну. Как и в том случае, цитоплазма окрашивается основными красителями, такими, как тионин, а нуклеоплазма не окрашивается. Однако нуклеоплазма имеет вид более узких пятен, чем при фазово-контрастной микроскопии живых клеток. Фиксированные OSO4 препараты пригодны для окрашивания нуклеоплазмы по Гимзе либо после гидролиза рибонуклеазой (100 мкг/мл в 1 мМ MgS04 в течение 30 мин), либо после гидролиза кислотой. Последний метод состоит из следующих стадий. [c.51]
Окраска капсул по методу Гинса. На конец предметного стекла микробиологической петлей наносят каплю черной туши, вносят в нее клетки, хорошо перемешивают и ребром покровного стекла делают мазок до всей поверхности стекла. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют 5—10 мин смесью Никифорова или 3 мин абсолютным метанолом. Далее мазок окрашивают карболовым фуксином Циля, разбавленным водой в соотношении 1 3. Время окрашивания — 2—3 мин. Препарат промывают водой, высущивают на воздухе и микроскопируют с иммерсионной системой. На темно-сером фоне препарата контрастна выделяются розово-малиновые клетки бактерий, окруженные бесцветными капсулами. [c.104]
Заключение в глицерин—желатину для фазово-контрастной микроскопии или окрашивание препаратов гемалауном—эозином или метиловым зеленым — пиронином. [c.291]
без названия
% PDF-1.7 % 1 0 объект > / OCG [9 0 R] >> / Контуры 10 0 R / PageLabels 11 0 руб. / Страницы 12 0 R / Тип / Каталог >> эндобдж 13 0 объект > эндобдж 2 0 obj > / Шрифт> >> / Поля [] >> эндобдж 3 0 obj > эндобдж 4 0 obj > транслировать 2017-02-27T14: 10: 59 + 05: 30Arbortext Advanced Print Publisher 10.0.1465 / W Unicode2018-08-27T01: 03: 59-07: 002018-08-27T01: 03: 59-07: 00Acrobat Distiller 10.0.0 (Windows) приложение / pdf
Контрастное окрашивание на основе йода улучшает микрокомпьютерную томографию атеросклеротических коронарных артерий
https://doi.org/10.1016/j.mex.2021.101297G права и содержаниеAbstract
Мы стремились разработать протокол обратимого окрашивания с использованием микрокомпьютерной томографии (микро-КТ) в сочетании с рентгеноконтрастным агентом, который позволяет in situ визуализировать и охарактеризовать атеросклеротические бляшки в трехмерном пространстве.Атеросклеротические коронарные артерии свиней отделяли от окружающего миокарда и инкубировали в йогексоле при различных концентрациях и времени инкубации, а затем визуализировали с помощью прямой рентгенографии. Профили линий были созданы на рентгеновском снимке артерии, чтобы определить эффективность рентгеноконтрастного агента для проникновения в ткань. Наши исследования показали, что для достаточного определения тканевых конструкций минимальная эффективная концентрация йогексола и время инкубации составляли 240 мгI / мл в течение 1 часа.Во всех группах 24 часа обесцвечивания вернули рентгеноконтрастность к контрольному уровню. После инкубации с йогексолом проводили микро-КТ. Наши результаты показывают, что увеличенное время окрашивания и минимальная концентрация йогексола 240 мгI / мл необходимы для эффективной перфузии тканей, что устраняет профиль распределения диффузии, свойственный способности контрастного вещества пересекать слои ткани.
- •
Йогексол улучшает ex vivo микро-КТ-визуализацию атеросклеротических коронарных артерий
- •
Йогексол позволяет улучшить сегментацию тканей во время анализа микро-КТ изображений
- •
Эффективность проникновения io ткань зависела от концентрации и продолжительности инкубации
Ключевые слова
Трехмерная визуализация
Сегментация артерии
Профиль сосудистой стенки
Виртуальная гистология
Рентгеноконтрастное вещество
Название метода
Атеросклеротическое контрастирование для коронарных артерий -CT
Рекомендуемые статьиЦитирующие статьи (0)
© 2021 Автор (ы).Опубликовано Elsevier B.V.
Рекомендуемые статьи
Цитирующие статьи
Оптимальное окрашивание связок и сухожилий контрастным веществом для рентгеновской компьютерной томографии
Abstract
Рентгеновская компьютерная томография стала важным инструментом для изучения микроструктуры биологических мягких тканей, таких как связки и сухожилия. Из-за низкого ослабления рентгеновских лучей такими тканями часто необходимы химические контрастные вещества для повышения контрастности во время сканирования.В этой статье оцениваются и сравниваются эффекты от использования трех различных контрастных веществ — раствора йодида калия, фосфорновольфрамовой кислоты и фосфорно-молибденовой кислоты. В основе исследования были передние крестообразные связки, сухожилия надколенника, медиальные коллатеральные связки и боковые коллатеральные связки свиней. Каждому трем образцам каждого из четырех типов связок / сухожилий был назначен другой контрастный агент (всего получилось двенадцать образцов), и продвижение этого агента через ткань контролировалось путем выполнения сканирования каждый день в течение всего пяти периодов. дней (всего шестьдесят сканирований).Поскольку образцы не были окрашены в первый день, к моменту последнего сканирования они были окрашены в общей сложности в течение четырех дней. Были измерены относительное усиление контраста и деформация ткани. Было обнаружено, что раствор йода иодида калия проникает в образцы быстрее всего и вызывает в среднем наименьшую усадку образца (хотя к моменту последнего сканирования наблюдается значительная деформация), тогда как фосфорномолибденовая кислота вызывает наибольшую усадку образца. Представлены уравнения, описывающие наблюдаемое поведение контрастных веществ, которые можно использовать для прогнозирования оптимального времени окрашивания для рентгеновской компьютерной томографии связок и сухожилий.
Образец цитирования: Балинт Р., Лоу Т., Ширер Т. (2016) Оптимальное окрашивание связок и сухожилий контрастным веществом для рентгеновской компьютерной томографии. PLoS ONE 11 (4): e0153552. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153552
Редактор: Томас Абрахам, Медицинский колледж Херши штата Пенсильвания, СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ
Поступила: 27 ноября 2015 г .; Дата принятия: 31 марта 2016 г .; Опубликовано: 14 апреля 2016 г.
Авторские права: © 2016 Balint et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.
Доступность данных: Данные профиля линии и файлы изображений виртуальных поперечных томографических срезов, из которых они были извлечены, доступны для загрузки. Файлы, связанные с образцами, окрашенными I2KI, имеют DOI: 10.15127 / 1.280262, файлы, связанные с образцами, окрашенными PTA, имеют DOI: 10.15127 / 1.280267, а те, которые связаны с образцами, окрашенными PMA, имеют DOI: 10.15127 / 1.280274.
Финансирование: TS хотел бы поблагодарить Совет по исследованиям в области инженерных и физических наук (EPSRC — https://www.epsrc.ac.uk/) за поддержку этой работы посредством его гранта для стипендий EP / L017997 / 1. Все авторы хотели бы выразить признательность за помощь, предоставленную Манчестерским центром рентгеновской визуализации, который частично финансировался EPSRC (гранты EP / F007906 / 1, EP / F001452 / 1 и EP / I02249X / 1).Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.
Введение
Рентгеновская компьютерная томография (РКТ) — важный инструмент для понимания механических свойств мягких тканей. Созданные XCT трехмерные (3D) изображения используются для измерения ключевых параметров, таких как объемная доля коллагена и направление выравнивания волокон, которые необходимы для создания математических моделей, описывающих поведение мягких тканей [1, 2].Хотя трехмерные изображения могут быть получены с помощью наслоения изображений с помощью сканирующего электронного микроскопа [3] или гистологических изображений [4], возможно, что артефакты будут индуцированы из-за снятия остаточного напряжения, когда образцы разрезаются на тонкие срезы, которые необходимы для такого техники. Например, известно, что аорта открывается в открытый сектор при разрезании [5]. Это, конечно, значительно отличается по геометрии от кольцевой цилиндрической формы естественной конфигурации in vivo аорты.С другой стороны, XCT — это быстрый метод, не требующий нарезки образцов. Следовательно, он позволяет получать трехмерные изображения тканей в конфигурации, намного более близкой к их естественному состоянию.
Основная трудность в получении полезных рентгеновских снимков мягких тканей заключается в их низком контрасте из-за низкого ослабления рентгеновских лучей. Это может затруднить различение двух разных типов мягких тканей. Чтобы преодолеть эту трудность, несколько авторов использовали контрастные вещества, которые идеально связываются с конкретной тканью и, следовательно, увеличивают контраст между ней и окружающей средой.Metscher [6,7] использовал раствор йодида калия (I2KI) и фосфорновольфрамовую кислоту (PTA) для усиления контраста в нескольких типах образцов, включая позвоночных, эмбрионы, насекомых и других беспозвоночных. Джеффри и др. . [8] смогли определить выравнивание мышечных пучков в головах грызунов с помощью окрашивания I2KI. I 2 KI также использовался Стефенсоном и др. . [9] и Асланиди и др. . [10] для усиления контраста в сердцах крыс и кроликов, автор de Crespigny et al .[11] для визуализации мозга мыши и Wong et al . [12] для изображения эмбрионов мыши. Пауэлс и др. . [13] исследовали диффузию 28 различных контрастных веществ в жировую и мышечную ткань свиней, а также в ноги мыши. Их исследование пришло к выводу, что йодид калия (KI) и вольфрамат натрия наиболее эффективно диффундируют в образцы мягких тканей, тогда как PTA, фосфомолибденовая кислота (PMA) и хлорид ртути (II) обеспечивают лучший контраст между различными типами мягких тканей.
Ключевым моментом при окрашивании образцов является время инкубации.Как чрезмерное, так и недостаточное окрашивание могут привести к нежелательным результатам. Если образец инкубируется в течение слишком короткого периода времени, пятно не сможет проникнуть в него полностью, и поэтому ткань будет сохранять низкий контраст в своем центре [14]. Однако чрезмерное окрашивание может привести к деформации образца и усадке ткани [15]. Таким образом, желательно определить оптимальное время инкубации, которое зависит как от типа ткани, так и от используемого контрастного вещества. Баттерс и др. . [16] исследовали оптимальное окрашивание I2KI сердец крыс, а Shearer et al .[14] исследовали оптимальное окрашивание I2KI и PTA передних крестообразных связок свиней (ACL) и сухожилий надколенника (PT) с использованием контрастных агентов низкой концентрации. В последнем исследовании контрастные вещества не диффундировали в центры образцов даже после 150 часов окрашивания, что, вероятно, было связано с их низкой (0,3% масс. / Об.) Концентрацией. Поэтому в настоящей работе красители использовались в гораздо более высоких концентрациях (10% мас. / Об.).
Насколько известно авторам, существует два существующих исследования, в которых микро-XCT используется для количественного измерения характеристик микроструктуры всей связки или сухожилия [14,17].В обоих исследованиях полученные трехмерные изображения использовались для отслеживания выравнивания пучков по длине образцов. В то время как Kalson et al . [17] смогли добиться этого без использования контрастных веществ, это произошло за счет времени сканирования, которое в этом исследовании составляло 12 часов. Использование контрастных веществ позволяет значительно сократить время сканирования (примерно 24 минуты в [14]). Если время сканирования может быть дополнительно сокращено, например, с помощью синхротрона в отличие от лабораторного источника рентгеновского излучения и / или за счет меньшего количества проекций, можно будет использовать рентгеновскую томографию с контрастным усилением, чтобы наблюдать, как выравнивание пучков изменяется в в реальном времени, когда связка или сухожилие растягиваются или подвергаются перекручиванию.Однако для того, чтобы сделать это эффективно, необходимо разработать оптимальный протокол окрашивания. Чтобы обеспечить автоматическую сегментацию изображений XCT, желательно добиться постоянного профиля интенсивности по всей глубине образца; поэтому интересно знать, как интенсивность на заданной глубине изменяется во времени по мере распространения пятна.
В предыдущих исследованиях, препарированные образцы поддерживались на их длине in vivo ; например, пришивая их к пластиковому стержню [17], или приклеивая их концы к дискам, которые удерживались друг от друга на фиксированном расстоянии [14]; однако при сканировании мягких тканей с целью их математического моделирования важно, чтобы они сохранялись как можно ближе к их свободным от напряжений конфигурациям, поскольку наличие напряжений может привести к неточностям моделирования [18].Эти напряжения также могут влиять на площадь поверхности образца и, следовательно, изменять время, необходимое контрастному веществу для диффузии в него. Таким образом, в этом исследовании образцы не хранили на их длине in vivo , а вместо этого им позволяли свободно висеть под их собственным весом, тем самым снимая любое напряжение, которое могло присутствовать.
Связки и сухожилия имеют сложную иерархическую структуру, состоящую из субъединиц многих различных масштабов длины. От самых больших до самых маленьких это: пучки (диаметром 50–400 мкм), волокна (10–50 мкм), фибриллы (50–500 нм), субфибриллы (10–20 нм), микрофибриллы (3.5 нм) и, наконец, молекула тропоколлагена (1,5 нм) [19,20]. Расположение этих субъединиц, которые встроены во внеколлагеновый матрикс, варьируется между разными типами связок и приводит к образованию пучков значительно разных размеров и форм [21,22]. XCT может использоваться для определения того, как морфология пучка изменяется не только в поперечном сечении, но и в 3D, и потенциально может использоваться для измерения объемной доли коллагена в данном образце.
В этой статье исследуется способность I2KI, PTA и PMA увеличивать контраст в XCT связок и сухожилий колена.Показано, что I2KI диффундирует в образцы наиболее быстро и вызывает наименьшую усадку образца, тогда как ПМА проникает в образцы медленнее всего и вызывает наибольшую усадку образца.
Материалы и методы
Заявление об этике
Связки, использованные в этом исследовании, были взяты из свиных ног, приобретенных у Kurpas Meats PLC (координаты местоположения: [53.471697, -2.175908]). Свиньи были забиты на бойне John Penny and Sons (координаты местоположения: [53.849531, -1.678699]) в соответствии с законами Соединенного Королевства о бойне. Животные не были забиты специально для исследований, а связки / сухожилия являются побочным продуктом мясной промышленности; следовательно, этическое одобрение не требовалось.
Пробоподготовка
ACL, PT, медиальные коллатеральные связки (MCL) и боковые коллатеральные связки (LCL) были отсечены от трех ног свиньи с прикрепленными костями, оставшимися на месте в течение 48 часов после убоя, в результате было получено двенадцать образцов.Верхний костный элемент каждого образца был приклеен к алюминиевой крышке контейнера из полистирола (источник: Starlab (UK), Ltd, Milton Keynes, UK) с использованием Loctite 435 (источник: Loctite UK & Ireland, Hemel Hempstead, UK). Затем образцу позволяли свободно висеть под собственным весом, чтобы он был как можно ближе к его конфигурации без напряжений. Все образцы фиксировали в 10% об. Растворе формалина и хранили в этом растворе до первого дня сканирования. Были приготовлены три различных контрастных вещества: 10% раствор I2KI [3.3% мас. / Об. Металлического йода (I 2 ) + 6,7% мас. / Об. KI в воде], 10% мас. / Об. Раствор PTA и 10% мас. / Об. Раствор PMA. Был выделен один образец каждого типа ткани для окрашивания каждым контрастным веществом. Это было сделано, чтобы избежать систематической ошибки из-за разного размера и содержания коллагена в четырех типах связок, использованных в этом исследовании [23].
Образцы сканировали один раз в день в течение пяти дней, при этом окрашивание происходило в течение ночи между сканированиями. Таким образом, образцы были неокрашенными для их первого сканирования в первый день и были окрашены в течение четырех дней ко времени их последнего сканирования на пятый день.Образцы удаляли из контрастного вещества только на время сканирования, во время которого они хранились в контейнерах из полистирола, упомянутых выше. На дно контейнеров был добавлен небольшой резервуар с фосфатно-солевым буфером, чтобы насытить влажность в них и, следовательно, минимизировать усадку образца из-за высыхания во время сканирования. Для поддержания необходимой концентрации контрастного вещества раствор для окрашивания меняли после каждого сканирования.
Процедура сканирования
Образцы получали с помощью системы Nikon Metris XT H 225 с аморфным кремниевым 14-битным детектором PaxScan® 4030E в Центре рентгеновской визуализации Генри Мозли в Университете Манчестера.Расстояние от источника до образца и от источника до детектора составляло 57,3 мм и 965 мм соответственно. Образцы помещались на вращающийся столик и сканировались с помощью вольфрамового источника с ускоряющим напряжением 60 кВ, током 280 мкА и коэффициентом усиления 30 дБ. Всего в 2001 году были сделаны прогнозы на 360 ° с временем экспозиции 708 мс / проекцию, что дает общее время съемки чуть менее 24 минут. Полученное разрешение составляло 7,5 мкм на воксель.
Анализ
После получения изображений наборы данных были реконструированы с помощью программы реконструкции Nikon Metris CT-Pro (Metris XT2.2, пакет обновления 10). Никакая коррекция усиления луча [24] или уменьшение шума не применялись, чтобы гарантировать, что интенсивность уровня серого каждого изображения не была искусственно изменена и, следовательно, была результатом диффузии только контрастных веществ.
После реконструкции были извлечены двумерные виртуальные поперечные срезы посередине каждой связки и сухожилия (см. Рис. 1). Профиль линии был нанесен через центр каждого среза шириной 10 пикселей. В качестве примера, профили линий LCL, окрашенного PTA, нанесены на рис. максимальная интенсивность, которая была записана по любому из шестидесяти профилей линий, которые были нанесены на график, таким образом давая число от 0 до 1).Край связки был идентифицирован с использованием трехэтапного процесса, основанного на описанном в [16]: 1) профиль линии был отфильтрован с помощью ядра Гаусса (σ = 4), 2) был определен максимальный градиент интенсивности, и 3) край был определен как следующая точка по направлению к центру образца, где абсолютное значение градиента интенсивности было приблизительно равно нулю (<0,01). Противоположный край был идентифицирован как последняя точка от центра образца, где абсолютное значение градиента интенсивности было приблизительно нулевым перед местоположением минимального градиента.Этот процесс проиллюстрирован для ACL, окрашенной PMA (после четырех дней окрашивания) на рис. 3. Наконец, чтобы удалить эффекты вариабельности образца в масштабе короткой длины, каждой точке в каждом образце было присвоено значение интенсивности, равное средней интенсивности в пределах 0,1 мм окрестности этой точки.
Рис. 1. Реконструированные виртуальные поперечные срезы XCT трех образцов ACL свиней.
Каждый образец окрашивали различным контрастным веществом (I2KI, PTA и PMA) в течение 0, 1, 2, 3 и 4 дней.Шкала шкалы = 10 мм.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153552.g001
Рис. 2. Поперечные срезы и нормализованные профили линий интенсивности для ПТА-окрашенного LCL после 0, 1, 2, 3 и 4 дней окрашивания.
Красные штрихи на поперечных срезах указывают пути профилированных линий. Шкала шкалы = 10 мм.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153552.g002
Рис. 3. Метод, принятый для обнаружения краев образца.
Сначала профиль нормализованной линии интенсивности фильтруется с помощью ядра Гаусса с σ = 4 (красная линия) для уменьшения шума. Был обнаружен максимальный (минимальный) градиент интенсивности, и край образца (пунктирная черная линия) был идентифицирован как следующая точка по направлению к центру образца, в которой абсолютное значение градиента интенсивности было приблизительно равным нулю (<0,01).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153552.g003
Чтобы сравнить эффекты трех контрастных агентов, после каждого сканирования измеряли нормированную интенсивность на 1 мм в каждый образец.Поскольку каждый контрастный агент использовался для окрашивания четырех разных образцов, с каждым пятном было связано четыре измерения. Функция формы (1) был подогнан к каждому набору данных и нанесен на график на рис. 4. В этом уравнении I0 — начальная нормализованная интенсивность, Imax — максимальная нормализованная интенсивность и k — параметр, связанный со скоростью диффузии.
Рис. 4. Средняя нормализованная интенсивность на глубине 1 мм в образцах как функция времени.
95% доверительные интервалы для подобранных функций отображаются в виде заштрихованных областей. Красный, сплошной — I2KI; синий, пунктирный — ЗБТ; пурпурный, пунктирный — ПМА.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153552.g004
Наблюдались качественные различия в поступлении различных контрастных веществ в образцы. I2KI быстро распространился в центры образцов, и последовало постепенное увеличение интенсивности повсюду. PTA и PMA, однако, демонстрировали четкий фронт диффузии, который медленно распространялся в образцы (см. Рис. 1).Чтобы учесть это различие, образцы, окрашенные I2KI, анализировали иначе, чем образцы, окрашенные PTA и PMA.
Образцы, окрашенные I2KI, анализировали с использованием метода, аналогичного тому, который использовался для анализа диффузии I2KI в сердца мышей в [16]. Средняя нормализованная интенсивность измерялась по глубине каждого образца, окрашенного I2KI, с шагом 0,1 мм и записывалась как функция времени. Функция формы, представленной в уравнении (1), была подогнана к данным при каждом пространственном приращении.Подобранные функции использовались для характеристики процесса диффузии и для расчета оптимального времени окрашивания как функции расстояния.
Для анализа образцов, окрашенных PTA и PMA, вместо применения процесса, описанного выше, местоположение фронта пятна рассчитывалось с использованием метода, аналогичного тому, который использовался для определения местоположения края образца: 1) перемещение от ранее определенный край по направлению к центру образца, первая точка в отфильтрованных данных с нормализованным градиентом интенсивности меньше -0.2, 2) следующая точка, в которой абсолютное значение нормализованного градиента интенсивности было приблизительно равным нулю (<0,01), была идентифицирована как край фронта пятна. Этот процесс проиллюстрирован на рис. 5 для ACL, окрашенной PTA (после 1 дня окрашивания). Среднее местоположение фронта окрашивания рассчитывали как функцию времени и использовали для расчета оптимального времени окрашивания как функции расстояния для образцов, окрашенных PTA и PMA.
Рис 5. Метод, принятый для определения местоположения передних краев пятна.
Профиль нормализованной линии интенсивности (красная линия) строится с расстоянием, измеренным от края образца. Чтобы обнаружить передний край, была определена первая точка, в которой нормализованный градиент интенсивности был меньше -0,2. Передний край был идентифицирован как следующая точка по направлению к центру образца, в которой абсолютное значение нормализованного градиента интенсивности было приблизительно равно нулю (<0,01).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153552.g005
Наконец, чтобы измерить вызванную пятнами усадку образцов, площадь поперечного сечения каждого образца была сегментирована и измерена с помощью пороговой обработки после каждого сканирования. Кроме того, 3D-изображения образцов сравнивались, чтобы качественно наблюдать деформацию из-за чрезмерного окрашивания.
Восстановленные поперечные срезы были просмотрены и профили линий были получены в программе ImageJ 1 . 49m (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Сегментация, расчеты площади поперечного сечения и 3D-рендеринг выполнялись в Avizo 9.0 (Visualization Sciences Group, Бордо (VSG), Франция). Различия между наборами данных профиля линий были проанализированы на предмет статистической значимости с использованием двустороннего дисперсионного анализа (ANOVA) и апостериорного критерия Тьюки в Mathematica 9 . 0 (Wolfram Research, Inc., Шампейн, Иллинойс, 2012 г.).
Результаты
Два качественных различия между тремя контрастными веществами можно наблюдать на рис. 4 с использованием подобранных значений параметров из уравнения 1, которые приведены в таблице 1.Во-первых, согласно прогнозируемым значениям Imax , можно видеть, что PTA обеспечивает наибольшее увеличение интенсивности на глубине 1 мм в образцах, за которыми следуют PMA и I2KI, которые дают аналогичное увеличение интенсивности. ANOVA выявил статистически значимую разницу в интенсивности между днями (p <0,001) и типами пятен (p = 0,01). Апостериорный тест Тьюки показал, что I2KI и PTA значительно различаются на уровне 5%, а PTA и PMA значительно различаются на уровне 10%.Во-вторых, последний столбец Таблицы 1 отображает нормализованную интенсивность после 4 дней окрашивания в виде процента от его максимальной прогнозируемой интенсивности с использованием значений в первых трех столбцах. Это показывает, что к этому времени образцы, окрашенные I2KI и PMA, приблизились к своей максимальной интенсивности, чем образцы, окрашенные PTA.
Таблица 1. Значения I0 , Imax и k , использованные для подгонки уравнения 1 к нормализованным профилям интенсивности образцов, окрашенных I2KI, PTA и PMA, как функция времени, наряду с нормализованными интенсивность после 4 дней окрашивания в процентах от Imax .https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153552.t001
Как упоминалось выше, для образцов, окрашенных I2KI, функция формы, приведенной в уравнении 1, была адаптирована к средним нормированным данным интенсивности в каждой точке. с шагом 0,1 мм в образцы. Чтобы определить оптимальное время окрашивания для I2KI, времена, когда интенсивность достигала 90%, 95% и 99% своего максимального значения при каждом пространственном приращении, были рассчитаны с использованием подобранных функций. После измерения этих величин для всех значений x (глубина в образцах) уравнение вида (2) был подогнан к данным, где tstain — необходимое время окрашивания, а A и c — константы, которые принимают разные значения для каждого из трех уровней насыщения.На рис. 6 показан результат этого процесса подбора в виде полулогарифмического графика. Установленные значения A и c приведены в Таблице 2. Подходящие уравнения можно использовать для прогнозирования оптимального времени окрашивания для данного уровня насыщения на определенной глубине; например, прогнозируется, что для достижения 90% насыщения на глубине 1,5 мм потребуется 1,6 дня, тогда как для достижения такого же насыщения на глубине 3 мм прогнозируется 2,6 дня.
Рис. 6. Полулогарифмический график необходимого времени окрашивания для различных уровней насыщения I2KI.
Кривые подбираются в соответствии с уравнением 2 с подобранными коэффициентами, приведенными в таблице 2. 95% доверительные интервалы для подобранных функций показаны в виде заштрихованных областей. Красный, сплошной — насыщенность 90%; синий пунктир — насыщенность 95%; пурпурный, пунктирный — насыщенность 99%.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153552.g006
Для образцов, окрашенных PTA и PMA, местоположение фронта пятна рассчитывали как функцию времени и функцию формы (3) был подогнан к данным, где C и K — константы подгонки.Полученная в результате аппроксимация представлена на рис. 7, а подогнанные значения C и K приведены в таблице 3. Существует статистически значимая разница между днями (p = 0,001), но нет статистически значимой разницы между двумя пятнами ( p = 0,38), как определено двухфакторным дисперсионным анализом.
Рис. 7. Расположение фронта пятна как функция времени.
Кривые подбираются в соответствии с уравнением 3 с подобранными коэффициентами, приведенными в таблице 3. 95% доверительные интервалы для подобранных функций показаны в виде заштрихованных областей.Слева: синий, сплошной — ЗБТ; справа: фиолетовый, пунктирный — ПМА.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153552.g007
Средние нормализованные площади поперечного сечения связок, окрашенных каждым контрастным веществом, представлены как функция времени на рис. 8. Нормализованное значение было вычислено. путем деления площади поперечного сечения в данном образце на его начальную площадь поперечного сечения (до любого окрашивания). Наибольшую усадку образца вызвал PTA, затем PMA, затем I2KI.Усадка была значительной: в среднем от 10% в образцах, окрашенных I2KI, до более 20% в образцах, окрашенных PTA. Большая часть усадки произошла в первый день окрашивания, и измеренные площади поперечного сечения после этого в среднем оставались довольно постоянными. Наблюдалась статистически значимая разница в площадях между днями (p <0,001) и типами пятен (p = 0,001), как определено с помощью двухфакторного дисперсионного анализа. Апостериорный тест Тьюки показал, что I2KI и PTA значительно различаются на уровне 1%, а PTA и PMA существенно различаются на уровне 5%.В дополнение к усадке имела место дальнейшая трехмерная деформация, как показано на фиг.9, которая была наиболее выражена в образце PT, окрашенном I2KI. На этом рисунке показано, как по мере того как образец сжимается, он начинает изгибаться назад сам по себе - увеличенная кривизна видна с левой стороны каждого объемного рендеринга с течением времени. Это указывает на то, что вызванная пятном усадка в этой связке оказывается неоднородной, при этом левая сторона (как показано на фиг.9) сжимается больше, чем правая.
Рис 8.Средние нормированные площади поперечного сечения образцов, окрашенных каждым типом контрастного вещества, нанесенные на график как функция времени.
Площадь поперечного сечения каждого образца была нормализована по неокрашенным образцам. Столбики показывают ± стандартную ошибку экспериментальных данных.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153552.g008
Обсуждение
На временных масштабах, рассмотренных в этом исследовании, диффузия I2KI оказалась качественно отличной от диффузии PTA и PMA — I2KI быстро достигал центра образцов, тогда как PTA и PMA распространялись с четким фронтом распространения.Возможно, что I2KI также диффундирует с четким фронтом, но этот фронт распространяется достаточно быстро, чтобы достичь центра всех образцов после одного дня окрашивания. В качестве альтернативы, градиент интенсивности может быть намного более мягким в образце, окрашенном I2KI, так что фронт не может быть идентифицирован. Чтобы полностью понять это поведение диффузии, требуется серия сканирований с более высоким временным разрешением, чем использованное в этом исследовании.
Рисунки 6 и 7 можно использовать для оценки количества времени, которое требуется образцу свиной связки для данного окрашивания, чтобы достичь адекватного усиления контраста.Например, для образца, окрашенного I2KI с радиусом 2 мм для достижения интенсивности 90% от его максимального потенциального значения, по оценкам, требуется время диффузии приблизительно от 1,7 до 2,0 дней с достоверностью 95%. Напротив, для достижения такой же глубины окраски PTA необходимо время диффузии не менее 1,8 дня, и это может занять более 4 дней с достоверностью 95%. Прогнозируется, что окрашивание такого образца ФМА займет не менее 2,6 дней с достоверностью 95%.Учитывая деформацию, которая возникает в образцах, окрашенных в течение таких периодов времени, размер связок, которые можно эффективно сканировать с помощью XCT с контрастным веществом, ограничен. Даже если не учитывать усадку образца, подобранные значения C предсказывают средний верхний предел радиуса образца около 3,1 мм (95% доверительный интервал: 0,02–5,2 мм) при использовании PTA и около 2,1 мм (95% доверительный интервал: 0,9–3,2 мм) при использовании PMA. Эти ограничения делают использование этих контрастных веществ нежизнеспособным для многих крупных (например,грамм. свиньи) связки / сухожилия.
Следует отметить, что оптимальное время окрашивания предсказано Баттерсом и др. . [16] для сердец мыши аналогичны оценкам здесь. В этом исследовании прогнозировалось, что время, необходимое I2KI для достижения интенсивности 90% от максимального потенциального значения на глубине 2 мм, составит чуть более 45 часов. Это может указывать на то, что различия в типе ткани, концентрации контрастного вещества (3,75% масс. / Об. В [16], по сравнению с 10% масс. / Об. Здесь) и растворителе контрастного вещества (10% об. / Об. Формалина в [16], по сравнению воды здесь) мало повлияло на требуемое время диффузии и что тип контрастного вещества является наиболее важным фактором.Однако нельзя исключать возможность того, что различия в этих факторах, которые взаимодействуют, чтобы случайно дать аналогичные результаты, не могут быть исключены.
Усадка образца, показанная на рис. 8, показывает, что контрастные вещества следует использовать с осторожностью в биологических мягких тканях. Учитывая измеренную усадку 10–25%, сомнительно, насколько надежными могут быть количественные измерения конкретных характеристик в образце, тем более, что усадка оказывается неоднородной, о чем свидетельствует рис. 9.В то время как усадка была гораздо менее выраженной после первого дня окрашивания, четкая деформация, показанная на рис. 9, подчеркивает необходимость минимизировать время окрашивания, даже если человек готов принять определенную величину усадки.
Ограничения
Края образцов были обнаружены путем определения местоположения максимального градиента интенсивности и определения следующей точки по направлению к центру образца, где градиент интенсивности был приблизительно равен нулю. Этот метод был выбран, поскольку он использовался Баттерсом и др. .в недавней статье [16] и, следовательно, позволяет прямое сравнение между двумя исследованиями. Если бы края в этом исследовании вместо этого были определены как точки максимального градиента интенсивности, тогда они были бы дальше от центра в среднем на 1,1% от общей расчетной ширины образца и максимум на 3,7% по всем шестидесяти линиям. профили. Таким образом, все значения глубины, указанные в этой статье, можно считать слегка заниженными.
Следует отметить, что артефакты в виде полос присутствуют на многих томографических срезах (см. Рис. 1).Это может быть результатом небольшого несовпадения выступов, снятых под разными углами (например, 0 ° и 180 ° или 90 ° и 270 °). Чтобы сократить время сканирования, образцы могли вращаться непрерывно, а не останавливаться перед съемкой каждого проецирования; следовательно, каждая проекция будет происходить в небольшом угловом диапазоне, а не под одним дискретным углом, что могло вызвать небольшое смещение. Таким образом, результирующие артефакты могут быть уменьшены за счет увеличения времени сбора данных, заставляя образцы перестать вращаться между каждой проекцией.В результате этих артефактов было невозможно автоматически сегментировать все объемы образцов в 3D. Следовательно, площади поперечного сечения томографических срезов, которые можно сегментировать , использовались для расчета оценок усадки образца, как показано на фиг. 8; однако эти измерения не учитывают 3D-эффекты. Также возможно, что часть наблюдаемой усадки в этом исследовании была результатом высыхания образцов во время сканирования. Попытка минимизировать этот источник усадки была сделана путем включения резервуара с фосфатно-солевым буфером в сканирующий сосуд; однако потребуется дальнейшая работа для количественного определения степени усадки, вызванной сушкой образца.
Деформация, наблюдаемая в образцах мягких тканей, окрашенных йодом, объясняется гипертонической природой йода [25], но можно в значительной степени устранить эту деформацию, введя этап стабилизации гидрогеля перед погружением контрастного вещества [25]. Было бы интересно исследовать, может ли аналогичная процедура подготовки уменьшить или устранить усадку в образцах, окрашенных PTA и PMA.
Целью данного исследования было определение оптимального времени диффузии с использованием контрастных веществ в постоянных условиях; однако многие факторы, которые могут повлиять на это время диффузии, не учитывались.Список этих факторов и значений, используемых в этом исследовании, приведен в таблице 4. Для определения относительного воздействия этих факторов потребуются дальнейшие исследования. Хотя было показано, что концентрация I2KI значительно влияет на результаты сканирования [10–12], насколько известно авторам, таких исследований влияния концентрации PTA или PMA не проводилось.
Выводы
Результаты этого исследования показывают, что усиление контраста при XCT связок и сухожилий свиней сильно зависит от времени диффузии.Оптимальное время окрашивания, представленное на рисунках 6 и 7, можно использовать в качестве ориентира для определения того, как долго образцы заданного размера должны быть погружены в контрастные вещества. Из-за значительной усадки образца и деформации, которая имеет место при длительном окрашивании, рекомендуется использовать XCT с контрастным усилением в первую очередь на небольших образцах связок / сухожилий.
Вклад авторов
Задумал и спроектировал эксперименты: TS TL. Проведены эксперименты: РБ ТС. Проанализированы данные: РБ ТС.Внесенные реагенты / материалы / инструменты анализа: TS. Написал статью: РБ ТС ТЛ.
Ссылки
- 1. Ширер Т. Новая функция энергии деформации для гиперупругого моделирования связок и сухожилий на основе микроструктуры пучка. J Biomech. 2015; 48: 290–297. pmid: 25482660
- 2. Ширер Т. Новая функция энергии деформации для моделирования связок и сухожилий, пучки которых имеют спиральное расположение фибрилл. J Biomech. 2015; 48: 3017–3025. pmid: 26283409
- 3.Денк В., Хорстманн Х. Серийная сканирующая электронная микроскопия лица для реконструкции трехмерной тканевой наноструктуры. PLoS Biol. 2004; 2: e329. pmid: 15514700
- 4. Робертс Н., Маги Д., Сонг Й., Брабазон К., Ширес М., Креллин Д. и др. К рутинному использованию трехмерной гистопатологии в качестве инструмента исследования. Am J Pathol. 2012; 180: 1835–1842. pmid: 224
- 5. Лю С.К., Фунг Ю.С. Нестрессовые состояния артерий. J Biomech Eng. 1988. 110: 82–84. pmid: 3347028
- 6.Metscher BD. МикроКТ для сравнительной морфологии: простые методы окрашивания позволяют получать высококонтрастные трехмерные изображения различных неминерализованных тканей животных. BMC Physiol. 2009; 9: 11. pmid: 19545439
- 7. Metscher BD. MicroCT для биологии развития: универсальный инструмент для контрастной трехмерной визуализации с гистологическим разрешением. Dev. Дин. 2009; 238: 632–640. pmid: 19235724
- 8. Джеффри Н.С., Стивенсон Р.С., Галлахер Дж. А., Джарвис Дж. С., Кокс П. Г.. Микрокомпьютерная томография с окрашиванием йодом разрешает расположение мышечных волокон.J Biomech. 2011; 44: 189–92. pmid: 20846653
- 9. Стивенсон Р.С., Бойетт М.Р., Харт Дж., Николайду Т., Кай Х, Корно А.Ф. и др. Микрокомпьютерная томография с контрастным усилением разрешает трехмерную морфологию проводящей системы сердца в сердцах млекопитающих. PLoS ONE. 2012; 7: e35299. pmid: 22509404
- 10. Асланиди О.В., Николайду Т., Чжао Дж., Смаилл Б.Х., Гилберт С.Х., Холден А.В. и др. Применение микрокомпьютерной томографии с окрашиванием йодом для визуализации сердца, сегментации и разработки компьютерных моделей.IEEE Trans Med Imaging. 2013; 32: 8–17. pmid: 22829390
- 11. де Креспиньи А., Боу-Реслан Х., Нисимура М.С., Филлипс Х., Карано Р.А., Арсей Х. Трехмерная микро-компьютерная томография головного мозга после смерти. Тенденции Genet. 2008. 171: 207–213.
- 12. Вонг, доктор медицины, Дорр, А.Е., Уоллс, младший, Лерх, Дж. П., Хенкельман, Р. М.. Новый трехмерный атлас эмбрионов мыши на основе микро-компьютерной томографии. Разработка 2012; 139: 3248–3256. pmid: 22872090
- 13. Пауэлс Э., Ван Лоо Д., Корнили П., Брабант Л., Ван Хорбек Л.Предварительное исследование контрастных веществ для визуализации мягких тканей с помощью рентгеновской компьютерной томографии высокого разрешения. J Microsc. 2013; 250: 21–31. pmid: 23432572
- 14. Ширер Т., Роусон С., Кастро С.Дж., Балинт Р., Брэдли Р.С., Лоу Т. и др. Рентгеновская компьютерная томография передней крестообразной связки и сухожилия надколенника. Мышцы Связки Сухожилия J. 2014; 4: 238–244. pmid: 25332942
- 15. Викертон П., Джарвис Дж., Джеффри Н. Зависимая от концентрации усадка образца в микро-КТ с йодом.J Anat. 2013; 223: 185–93. pmid: 23721431
- 16. Баттерс Т.Д., Кастро С.Дж., Лоу Т., Чжан Ю., Лей М., Уизерс П.Дж. и др. Оптимальное йодное окрашивание сердечной ткани для рентгеновской компьютерной томографии. PLoS ONE. 2014; 9: e105552. pmid: 25170844
- 17.
Калсон Н.С., Мэлоун PSC, Брэдли Р.С., Уизерс П.Дж., Лис В.К. Пучки волокон в сухожилии локтевого разгибателя запястья человека расположены по спирали. J Hand Surg Eur Vol. 2012; 37: 550–554. pmid: 221
- 18. Эльшейх А., Уитфорд С., Хамарашид Р., Кассам В., Йода П., Бюхлер П.Безстрессовая конфигурация человеческого глаза. Med Eng Phys. 2013; 35: 211–216. pmid: 23041490
- 19. Kastelic J, Galeski A, Baer E. Мультикомпозитная структура сухожилия. Conn. Tiss. Res. 1978; 6: 11–23.
- 20. Screen HRC, Bader DL, Lee DA, Shelton JC. Измерение локальной деформации в сухожилии. Напряжение. 2004. 40: 157–163.
- 21. Yahia L-H, Drouin G. Структура коллагена в передней крестообразной связке человека и сухожилии надколенника. J. Mater. Sci.1988. 23: 3750–3755.
- 22. Yahia L-H, Drouin G. Микроскопическое исследование передней крестообразной связки и сухожилия надколенника собак: морфология и архитектура коллагенового пучка. J. Orthop. Res. 1989; 7: 243–251. pmid: 2918423
- 23. Элешварапу С.В., Responte DJ, Атанасиу К.А. Растяжимость, содержание коллагена и сшивки в соединительных тканях незрелого коленного сустава. PLoS ONE. 2011; 6: e26278.
- 24. Девульф В., Тан И., Кикенс К.Смысл и бессмысленность коррекции упрочнения пучка в КТ метрологии. CIRP Ann — Manuf Tech. 2012; 61: 495–498.
- 25. Вонг, доктор медицины, Спринг С., Хенкельман, Р.М. Структурная стабилизация ткани для фенотипирования эмбрионов с помощью микро-КТ с окрашиванием йодом. PLoS ONE. 2013; 8: e84321. pmid: 24386367
методов дифференциального окрашивания | Микробиология: лабораторный опыт
Просмотр бактериальных клеток
Микроскоп — очень важный инструмент в микробиологии, но существуют ограничения, когда дело доходит до его использования для наблюдения за клетками в целом и бактериальными клетками в частности.Двумя наиболее важными проблемами являются разрешение и контраст. Разрешение — это ограничение, с которым мы ничего не можем поделать, поскольку большинство бактериальных клеток уже близки к пределу разрешения большинства световых микроскопов. Тем не менее, контраст можно улучшить либо с помощью оптической системы другого типа, например, фазового контраста или микроскопа с дифференциальным интерференционным контрастом, либо путем окрашивания клеток (или фона) хромогенным красителем, который не только добавляет контраст, но и дает им тоже цвет.
В микробиологии используется множество различных красителей и процедур окрашивания. Некоторые включают одно пятно и всего несколько шагов, в то время как другие используют несколько пятен и более сложную процедуру. Прежде чем вы сможете начать процедуру окрашивания, клетки должны быть закреплены (размазаны) и зафиксированы на предметном стекле.
Бактериальный мазок — это просто небольшое количество культуры, растекающееся в виде очень тонкой пленки на поверхности предметного стекла. Чтобы предотвратить вымывание бактерий во время этапов окрашивания, мазок может быть химически или физически «прикреплен» к поверхности предметного стекла.Тепловая фиксация — это простой и эффективный метод, который достигается путем кратковременного пропускания предметного стекла через пламя горелки Бунзена, в результате чего биологический материал становится более или менее прочно прикрепленным к поверхности стекла.
Термофиксированные мазки готовы к окрашиванию. При простом окрашивании в мазок добавляются красители, которые либо притягиваются зарядом (катионный краситель, такой как метиленовый синий или кристаллический фиолетовый), либо отталкиваются зарядом (анионный краситель, такой как эозин или тушь). Катионные красители связывают бактериальные клетки, что хорошо видно на ярком фоне.Анионные красители отталкиваются клетками, поэтому клетки становятся яркими на окрашенном фоне. Примеры того и другого см. На рисунках 1 и 2.
Рисунок 1. Отрицательное окрашивание Cyptococcus neoformans , инкапсулированных дрожжей
Рис. 2. Положительное окрашивание на Staphylococcus aureus.
Вероятно, наиболее важной особенностью, которая становится очевидной при окрашивании бактериальных клеток, является их клеточная морфология (не путать с морфологией колоний, которая представляет собой появление бактериальных колоний на чашке с агаром).Большинство гетеротрофных и культивируемых бактерий имеют несколько основных форм: сферические клетки (кокки / кокки), палочковидные клетки (палочки / бациллы) или палочковидные клетки с изгибами или изгибами (вибрионы и спириллы соответственно). Существует большее разнообразие форм среди архей и других бактерий, встречающихся в экосистемах, отличных от человеческого тела.
Часто бактерии создают определенные структуры клеток, которые образуются в результате бинарного деления бактериями во время их размножения. Договоренности особенно очевидны с неподвижными бактериями, потому что клетки имеют тенденцию оставаться вместе после завершения процесса деления.И форма, и расположение клеток являются характеристиками, которые можно использовать для различения бактерий. Наиболее часто встречающиеся формы бактерий (кокки и бациллы) и их возможное расположение показаны на рисунках 3 и 4.
Рисунок 3. Возможное расположение бактериальных клеток для кокков
Рис. 4. Возможное расположение бактериальных клеток для бацилл
Дифференциальные методы окрашивания
В микробиологии методы дифференциального окрашивания используются чаще, чем простые окрашивания, как средство сбора информации о бактериях.Методы дифференциального окрашивания, которые обычно требуют более одного окрашивания и нескольких этапов, называются таковыми, потому что они позволяют дифференцировать типы клеток или клеточные структуры. Самым важным из них является окраска по Граму. Другие методы дифференциального окрашивания включают окрашивание эндоспор (для выявления бактерий, образующих эндоспоры), кислотостойкое окрашивание (для отличия видов Mycobacterium от других бактерий), метахроматическое окрашивание для выявления гранул, накапливающих фосфаты, и окрашивание капсул (для идентификации инкапсулированные бактерии).Мы будем выполнять процедуры окрашивания по Граму и эндоспор в лаборатории и просматривать подготовленные слайды, которые выделяют некоторые другие клеточные структуры, присутствующие в некоторых бактериях.
Пятно по грамму
Рис. 5. Бактерии, окрашенные по Граму.
В 1884 году врач Ганс Кристиан Грам изучал этиологию (причину) респираторных заболеваний, таких как пневмония. Он разработал процедуру окрашивания, которая позволила ему идентифицировать бактерии в легочной ткани, взятой у умерших пациентов, как этиологический агент фатальной пневмонии.Хотя метод окрашивания по Граму мало помог в лечении болезни, он значительно упростил диагностику причины смерти человека при вскрытии. Сегодня мы используем методы окрашивания по Граму, чтобы помочь в идентификации бактерий, начиная с предварительной классификации на одну из двух групп: грамположительные или грамотрицательные .
Дифференциальный характер окраски по Граму основан на способности некоторых бактериальных клеток сохранять первичное окрашивание (кристаллический фиолетовый), сопротивляясь процессу обесцвечивания.Окрашивание по Граму включает четыре этапа. Сначала клетки окрашивают кристаллическим фиолетовым с последующим добавлением фиксирующего агента для окрашивания (йода). Затем применяется спирт, который выборочно удаляет пятно только с грамотрицательных клеток. Наконец, добавляется вторичный краситель, сафранин, который окрашивает обесцвеченные клетки в розовый цвет.
Хотя в то время Грам не знал этого, основное различие между этими двумя типами бактериальных клеток заключается в их клеточных стенках. Стенки грамотрицательных клеток имеют внешнюю мембрану (также называемую оболочкой), которая растворяется во время мытья спиртом.Это позволяет ускользнуть кристально-фиолетовому красителю. Только обесцвеченные клетки поглощают розовый краситель сафранин, что объясняет разницу в цвете между двумя типами клеток. По завершению процедуры окрашивания по Граму, грамположительные клетки появляются фиолетовыми, и грамотрицательные клетки появляются розовыми.
При интерпретации мазка, окрашенного по Граму, необходимо также описать морфологию (форму) клеток и их расположение. На рисунке 5 представлены два различных типа бактерий, которые можно различить по реакции окрашивания по Граму, а также по их форме и расположению.Ниже опишите эти характеристики для обеих бактерий:
Грамположительные бактерии: Грамотрицательные бактерии: Морфология Расположение Кислотостойкое пятно
Некоторые бактерии производят восковое вещество миколическая кислота , когда они строят свои клеточные стенки.Миколиновая кислота действует как барьер, защищающий клетки от дегидратации, а также от фагоцитоза клетками иммунной системы хозяина. Этот восковой барьер также предотвращает проникновение пятен в клетку, поэтому окраска по Граму не работает с микобактериями, такими как Mycobacterium , которые являются патогенами людей и животных. Для этих бактерий используется метод окрашивания acid — fast .
Рисунок 6. Кислотоустойчивые бациллы в мокроте
Для проведения кислотостойкого окрашивания термофиксированный мазок заливают основным красителем карбол фуксином, а предметное стекло нагревают на водяной бане с паром.Тепло «плавит» восковую клеточную стенку и позволяет клеткам поглощать краситель. Затем слайду дают остыть и добавляют раствор кислоты и спирта в качестве обесцвечивающего средства. Клетки, которые являются «кислотоупорными» из-за миколовой кислоты в их клеточной стенке, сопротивляются обесцвечиванию и сохраняют первичное окрашивание. Все остальные типы клеток обесцвечиваются. Затем метиленовый синий используется в качестве контрастного красителя. В конце концов, кислотоустойчивые бактерии (КУБ) будут окрашены в ярко-розовый цвет, а все другие типы клеток станут синими.
Методы окрашивания для выделения специфических клеточных структур
Капсула : полисахаридная слизь, окружающая некоторые виды бактерий и несколько типов эукариотических микробов, лучше всего визуализируется при отрицательном окрашивании клеток. В этом методе бактерии сначала смешиваются с пятном, а затем капля смеси распределяется по поверхности предметного стекла в виде тонкой пленки. При использовании этого метода капсулы выглядят как прозрачный слой вокруг бактериальных клеток с темным фоном.
Метахроматический гранулы или другой интрацитоплазматический тельца : Некоторые бактерии могут содержать окрашенные тельца-накопители. Одним из примеров является грамположительная палочка Corynebacterium , которая накапливает фосфат в структурах, называемых «волютин», или метахроматических гранулах, находящихся внутри клеточной мембраны. Для визуализации внутрицитоплазматических тел у бактерий используются различные методы окрашивания, которые часто дают ключ к идентификации при наблюдении в клетках.
Эндоспорное пятно
Эндоспоры — это спящие формы живых бактерий, и их не следует путать с репродуктивными спорами, продуцируемыми грибами. Эти структуры производятся несколькими видами грамположительных бактерий, почти всеми бациллами, в ответ на неблагоприятные условия окружающей среды. Две распространенные бактерии, продуцирующие эндоспоры, — это Bacillus или Clostridum . Оба живут в основном в почве и как симбионты растений и животных и производят эндоспоры, чтобы выжить в быстро и часто меняющейся среде.
Процесс эндоспоруляции (образование эндоспор) включает несколько этапов. После того, как бактериальная клетка реплицирует свою ДНК, образуются слои пептидогликана и белка, окружающие генетический материал. После полного формирования эндоспора высвобождается из клетки и может бездействовать в течение нескольких дней, недель или лет. Когда преобладают более благоприятные условия окружающей среды, эндоспоры прорастают и возвращаются к активной работе в качестве вегетативных клеток.
Зрелые эндоспоры обладают высокой устойчивостью к условиям окружающей среды, таким как тепло и химические вещества, что позволяет бактериям выжить в течение очень долгого времени.Эндоспоры, образовавшиеся миллионы лет назад, были успешно возвращены к жизни, просто обеспечив их водой и пищей.
Поскольку оболочка эндоспор очень устойчива к окрашиванию, был разработан специальный метод, чтобы их было легче увидеть в светлопольном микроскопе. Этот метод, называемый красителем endospore , использует либо тепло, либо длительное время воздействия, чтобы побудить эндоспоры принять первичное пятно, обычно водорастворимый краситель, такой как малахитовый зеленый, поскольку эндоспоры проницаемы для воды.После этапа обесцвечивания, который удаляет краситель из вегетативных клеток в мазке, наносится контрастное сафранин для обеспечения цвета и контраста. При окрашивании этим методом эндоспоры становятся зелеными, а вегетативные клетки окрашиваются в розовый цвет, как показано на Рисунке 7.
Рисунок 7. Бактериальные клетки с эндоспорами, окрашенные методом окраски эндоспор.
Рис. 8. Бациллы с эндоспорами при фазово-контрастной микроскопии.
Хотя сами эндоспоры устойчивы к методу окрашивания по Граму, бактериальные клетки, захваченные в процессе создания этих структур, могут быть окрашены.В этом случае эндоспоры выглядят как четкие овальные или сферические области внутри окрашенной клетки. Эндоспоры также можно непосредственно наблюдать в клетках с помощью фазово-контрастной микроскопии, как показано на Рисунке 8.
Поскольку многие методы дифференциального окрашивания требуют нескольких этапов и длительного времени, мы не будем выполнять все методы дифференциального окрашивания, описанные выше.
Предварительно окрашенные слайды будут использоваться для визуализации бактериальных капсул, метахроматических гранул и кислотоустойчивых бацилл.Возьмите по одному слайду каждой из трех бактерий, перечисленных в таблице ниже. Просматривая эти слайды, обращайте внимание на «выделенные» структуры. У вашего изолята из окружающей среды может быть одна или несколько из этих клеточных функций, и умение распознавать их поможет в идентификации. Все это следует рассматривать с помощью масляного иммерсионного объектива.
Бактерии Пятно Описание или эскиз ячеек с указанным признаком Flavobacterium capsulatum Капсульное пятно Corynebacterium diphtheriae Метиленовый синий (метахроматические гранулы) Mycobacterium tuberculosis Кислотостойкое краситель Пятно по грамму
Все процедуры окрашивания следует проводить над раковиной.Будет продемонстрирована процедура окрашивания по Граму, а обзор представлен в таблице 1.
Таблица 1. Процедура окрашивания по Граму. Шаг Процедура Результат Первичная окраска (кристально-фиолетовый) Добавьте несколько капель кристаллического фиолетового в мазок и оставьте на 1 минуту. Промойте предметное стекло водой. И грамположительные, и грамотрицательные клетки будут окрашены в пурпурный цвет кристаллическим фиолетовым красителем. Протрава (йод) Добавьте несколько капель йода в мазок и оставьте на 1 минуту. Промойте предметное стекло водой. Йод «устанавливает» кристаллический фиолетовый цвет, поэтому оба типа бактерий остаются фиолетовыми. Обесцвечивание (этанол) Добавьте капли этанола одну на a время , пока сток не станет прозрачным.Промойте предметное стекло водой. Грамположительные клетки сопротивляются обесцвечиванию и остаются пурпурными. Краситель высвобождается из грамотрицательных клеток. Контркрашивание (сафранин) Добавьте несколько капель сафранина в мазок и оставьте на одну минуту. Промойте предметное стекло водой и просушите салфеткой. Грамотрицательные клетки будут окрашены сафранином в розовый цвет. Этот краситель не действует на грамположительные клетки, которые остаются фиолетовыми. Доброволец с вашего лабораторного стола должен получить культуры бактерий, которые вы будете использовать в этой лаборатории, в соответствии с указаниями вашего инструктора.Одна из культур будет грамположительной бактерией, а другая — грамотрицательной. Ниже напишите названия бактерий, которые вы будете использовать, вместе с BSL для каждой культуры:
__________________________________________________________________________________
Возьмите два предметных стекла и приготовьте мазок каждой из двух бактериальных культур, по одному на предметное стекло, как показано. Дайте ПОЛНОСТЬЮ высохнуть на воздухе и закрепите при нагревании. Окрашивайте оба мазка методом окраски по Граму.Наблюдайте за предметными стеклами с помощью светового микроскопа при увеличении в 1000 раз и запишите свои наблюдения в таблице ниже.
Название культуры Реакция окрашивания по Граму Морфология клетки Композиция Пятно по Граму «Заключительный осмотр»: приготовьте мазок, содержащий смесь грамположительных И грамотрицательных бактерий, добавив небольшое количество каждой бактерии в одну каплю воды на предметном стекле.Тепло зафиксируйте мазок и окрасите его по Граму. Вы должны быть в состоянии определить реакцию окрашивания по Граму, клеточную морфологию и расположение ОБЕИХ бактерий в этом смешанном мазке. Ваш преподаватель может попросить показать этот слайд и предложить конструктивный комментарий.
Эндоспорное пятно
Лишь несколько родов бактерий продуцируют эндоспоры, и почти все они являются грамположительными бациллами. Наиболее заметными являются виды Bacillus и Clostridium , которые естественным образом обитают в почве и являются обычными загрязняющими веществами на поверхностях.Рост Clostridium spp. обычно ограничивается анаэробной средой; Bacillus spp. может расти как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Эндоспорообразующие бактерии отличаются от других групп грамположительных бацилл и различаются по их эндоспорам.
Обзор процедуры окрашивания эндоспор представлен в таблице 2.
Таблица 2. Этапы процедуры окрашивания эндоспор. Шаг Процедура Результат Первичная окраска (малахитовый зеленый) Добавьте несколько капель малахитового зеленого в мазок и оставьте на 10 минут.Если пятно начинает высыхать, добавьте дополнительные капли. Вегетативные клетки немедленно поглощают первичную окраску. Эндоспоры устойчивы к окрашиванию, но со временем впитывают краситель. Обесцвечивание (вода) Промойте предметное стекло под слабой струей воды в течение 10-15 секунд. После окрашивания эндоспоры остаются зелеными. Тщательное ополаскивание водой обесцвечивает вегетативные клетки. Контркрашивание (сафранин) Добавьте несколько капель сафранина в мазок и оставьте на 1 минуту.Промойте предметное стекло и промокните насухо. Обесцвеченные вегетативные клетки принимают контрастное пятно и становятся розовыми; эндоспоры светло-зеленые. После окрашивания эндоспоры обычно выглядят как светло-зеленые овальные или сферические структуры, которые можно увидеть внутри или за пределами вегетативных клеток, которые выглядят розовыми.
Форма и расположение эндоспор внутри бактериальных клеток, а также то, расширяет ли спорангий (D) или не расширяет (ND) стороны клетки, являются важными характеристиками, которые помогают в дифференциации между видами (см. Рисунок 9) .
Рисунок 9
- Овальный, центральный, без вздутия (ND)
- Овальный, концевой, ND (и параспоральный кристалл)
- Овальный, концевой, растянутый (D)
- Овальный, центральный, D
- Сферический, концевой, D
- Овальный, боковой, D
Эндоспоры довольно устойчивы к большинству процедур окрашивания; однако в мазках с обычным окрашиванием они могут быть видны как «очертания» с чистым пространством внутри. Если вы наблюдаете «очертания» или то, что кажется «призраками» клеток в мазке, окрашенном по Граму, грамположительных бацилл, то также следует выполнить окрашивание эндоспор, чтобы подтвердить наличие или отсутствие эндоспор.
Волонтер из вашего лабораторного стола должен получить бактериальные культуры для окрашивания эндоспор в соответствии с указаниями вашего инструктора. Обратите внимание, что все это будут виды Bacillus . Приготовьте мазки и окрасьте каждый, используя технику окрашивания эндоспор. Посмотрите на слайды и отметьте форму и расположение эндоспоры, а также внешний вид спорангия (опухший или не опухший) в таблице ниже:
Название культуры Форма эндоспоры Расположение Спорангий Кроме того, выберите ОДНУ из представленных выше культур и окрасите ее по Граму.Запишите свои результаты ниже в отведенных местах:
Название культуры, окрашенной по Граму: __________________________________________________
Реакция окрашивания по Граму и клеточная морфология: ______________________________________
Видны ли эндоспоры в мазке, окрашенном по Граму? _________________ Если вы видите эндоспоры, опишите, как они выглядят в препарате, окрашенном по Граму, и чем он похож и отличается от того, что вы видите в препарате, окрашенном по Граму.
MicroCT для сравнительной морфологии: простые методы окрашивания позволяют получать высококонтрастные трехмерные изображения различных неминерализованных тканей животных | BMC Physiology
Результаты, представленные здесь, отражают опыт автора с образцами и методами лечения, протестированными на данный момент, и эти примеры предназначены для иллюстрации некоторых возможностей микроКТ-исследований различных проблем, которые требуют или будут получать пользу от трехмерных морфологических данных. Одним из наиболее важных практических результатов этого исследования является то, что каждый новый тип образца должен быть протестирован с различными фиксациями и окрашиванием, чтобы найти лучшее лечение для требуемой визуализации.
Позвоночные
Было обнаружено, что окрашивание PTA и йодом придает резкий тканевый контраст образцам рыб и амфибий. Особенно хорошие результаты были получены при окрашивании ФТА фиксированного материала Буэна или глиоксаля (рис. 2, 3 и 4), а также при окрашивании IKI после фиксации формалином (рис. 5). Известно, что РТА связывается с коллагеном и другими белками [28], и мускулатура отчетливо демонстрируется на томографических изображениях вместе с другими структурами (Рисунки 2, 4, Дополнительные файлы 1, 2).Хрящ не сильно окрашивается PTA, но появляется в виде пробелов на объемных изображениях. Однако отдельные гипертрофические хондроциты в хрящевой матрице можно четко увидеть на виртуальных срезах с высоким разрешением (рис. 3, внизу). IKI (10% водн.), Нанесенный на образцы, все еще находящиеся в водной среде, придавал дифференциальный рентгеновский контраст, по крайней мере, такой же высокий, как при использовании PTA. Нервные ткани также хорошо видны с обоими пятнами, и различные слои мозга можно легко различить (рисунки 3, 5, дополнительный файл 3).
Рисунок 2Несколько изображений из одного сканирования веслоноса в течение 7 дней после вылупления ( Лопатка Polyodon ) . Фиксируется в Буэна, хранится в 70% этаноле, окрашивается PTA. Регулируя функции окна и прозрачности, можно сделать объемный рендеринг, чтобы показать сочетание внутренних и внешних структур. На этих изображениях особенно выделяются рецепторы боковой линии, а также носовые капсулы и мышцы. Размер вокселя 5,6 мкм.Дополнительные файлы 1 и 2 представляют собой видеоролики в формате QuickTime с другими сканированными изображениями веслоноса, окрашенными РТА, одним ранее (через 4 дня после вылупления) и одним позже (общая длина 27 мм).
Рисунок 3Виртуальные срезы фиксированных по Буэну и окрашенных PTA образцов рыб . Две верхние секции: Polyodon , 10 дней после вылупления, горизонтальные секции через голову. В верхнем разрезе показаны зрительные нервы, слои сетчатки и участки приводящих мышц челюсти. Средний отдел более дорсальный и показывает нейрокраниальный хрящ и слуховые камеры.Оба среза показывают дифференциальное окрашивание тканей мозга и органов обоняния. Размер вокселя 4,3 мкм. Внизу: европейский хариус ( Thymallus thymallus ), зафиксированный в формалине и окрашенный PTA. В этом разделе показаны наружный наркоз (вверху), обонятельный эпителий и обонятельный нерв, а также черепной хрящ. Размер вокселя 2,1 мкм.
Рисунок 4Трехмерное изображение аксолотля ( Ambystoma mexicanum ), питающегося личинкой .Фиксированный глиоксалем, хранящийся в 70% этаноле, окрашенный ПТА. В левом столбце показаны внешние виды с дорсальной, левой и вентральной сторон, при этом для ясности половина фона удалена. В правом столбце показаны те же виды, но с удаленным наполовину передним планом. Окрашивание PTA выделяет мышцы и нервные ткани, а также органы чувств: обратите внимание на выступающие носовые капсулы и невромасты. Горизонтальная планка = 500 мкм. Размер вокселя 9,6 мкм.
Рисунок 5Щука (Esox lucius) мальки, зафиксированные в формалине и окрашенные IKI .Объемные визуализации и виртуальные срезы, сделанные из объединенных стопок реконструированных срезов из двух сканирований микро-КТ, сделанных с образцом на одной оси вращения (т. Е. С преобразованием только в передне-заднем направлении), одно сканирование головы рыбы, а другое — грудной клетки. область. Эта процедура позволила сканировать обе области тела с более высоким разрешением (за счет дополнительного времени). Слева: внешние виды рендеринга общего объема с настройкой прозрачности для выявления некоторых внутренних структур.Вверху справа: среднесагиттальный разрез того же объема. В центре справа: горизонтальный виртуальный разрез с одним вокселем через объемное изображение. Внизу справа: корональные сечения одного и того же набора объемных изображений. На одном показаны слои головного мозга, сечения приводящих мышц челюсти и хрящи жаберных дуг; на другом — слои сетчатки, связи с зрительными нервами и линзы, которые имеют тенденцию к очень сильному окрашиванию. Горизонтальная планка = 500 мкм. Размер вокселя 4,0 мкм. Дополнительный файл 3 — это фильм в формате QuickTime с реконструкцией объема по этим сканированным изображениям.
Мальки щуки ( Esox lucius ) фиксировали в формалине и окрашивали IKI . Объемные визуализации и виртуальные срезы, сделанные из объединенных стопок реконструированных срезов из двух сканирований микро-КТ, сделанных с образцом на одной оси вращения (т. Е. С преобразованием только в передне-заднем направлении), одно сканирование головы рыбы, а другое — грудной клетки. область. Эта процедура позволила сканировать обе области тела с более высоким разрешением (за счет дополнительного времени).Слева: внешние виды рендеринга общего объема с настройкой прозрачности для выявления некоторых внутренних структур. Вверху справа: среднесагиттальный разрез того же объема. В центре справа: горизонтальный виртуальный разрез с одним вокселем через объемное изображение. Внизу справа: корональные сечения одного и того же набора объемных изображений. На одном показаны слои головного мозга, сечения приводящих мышц челюсти и хрящи жаберных дуг; на другом — слои сетчатки, связи с зрительными нервами и линзы, которые имеют тенденцию к очень сильному окрашиванию.Горизонтальная планка = 500 мкм. Размер вокселя 4,0 мкм. Дополнительный файл 3 — это фильм в формате QuickTime с реконструкцией объема по этим сканированным изображениям.
Для образцов, хранящихся в спирте, эффективное окрашивание было получено с использованием 1% металлического йода в абсолютном этаноле или метаноле (I2E или I2M; см. Таблицу 2). Этот метод особенно полезен для архивных или музейных образцов, хранящихся в 70–95% этаноле (например, минога на Рисунке 6), а также для образцов, сохраненных в метаноле, как для гибридизации in situ (например, веслоноса на Рисунке 7).Эффекты предшествующей дегидратации очевидны, и окрашивание немного менее отчетливо, чем при обработке образцов, зафиксированных для целей микроКТ. Стоит отметить, что йод не оказывал эффективного окрашивания в 70% спирте, поэтому образцы перед окрашиванием пришлось перенести в 100% спирт.
Рисунок 6Молодь миноги ( Lampetra ), сканированная с помощью SkyScan 1174 . После хранения в спирте фиксируется в формалине и окрашивается I2E.Весь образец был около 10 см в длину. Вверху: вид снизу объемной визуализации с горизонтальным вырезом. В центре: внешний вид области головы. Внизу: единый реконструированный парасагиттальный разрез. Размер вокселя 15 мкм. Образец предоставлен Daniel Sidertis, Univ. Вена.
Рисунок 7Окрашивание образцов, консервированных метанолом, йодом (I2M) . Слева: веслонос Polyodon spathula , через 11 дней после вылупления, фиксированный формалином и обезвоженный метанолом для гибридизации in situ, окрашенный I2M.Размер вокселя 5,1 мкм. Справа: зеленый осетр ( Acipenser medirostris , общая длина 65 мм; любезно предоставлен Бойдом Кинардом из Conte Anadromous Fish Laboratory, Массачусетс), закрепленный в Dent’s и хранящийся в метаноле, окрашенный I2M для демонстрации грудной мускулатуры. Йод имеет тенденцию перекрашивать кальцинированные ткани: поглощение рентгеновских лучей костями, щитками и лепидотрихиями находится за пределами окна яркости изображения на этих изображениях. Масштабная линейка = 1 мм. Размер вокселя 9,2 мкм.
Точно откалиброванные трехмерные изображения опорно-двигательного аппарата можно также использовать для количественной оценки количества мышечных волокон и площади поперечного сечения, областей прикрепления мышц, размеров и формы костей или хрящей, а также для облегчения функционального моделирования (как в [32]).
Эмбрионы позвоночных
В отдельном отчете уже были описаны и оценены методы, используемые здесь для окрашивания и визуализации куриных эмбрионов с помощью микроКТ [22]. Для настоящего отчета несколько фиксированных формалином эмбрионов Xenopus были окрашены IKI и PTA с довольно похожими результатами (рис. 8). Общие признаки, такие как глоточные мешочки, присоска, слуховые и глазные пузырьки, четко различимы, как и мерцательные эпидермальные клетки, эпифиз и дифференцирующаяся нервная трубка.
Рисунок 8Xenopus эмбрион, стадия ок. 27 . Фиксируют в формалине и окрашивают PTA (слева) и IKI (справа). Внизу: виртуальные горизонтальные участки толщиной в 1 воксел; масштабная линейка = 100 мкм. Размер вокселя 2,1 мкм (слева) и 3,2 мкм (справа). Образцы предоставлены Daniel Sidertis, Univ. Вена.
Эмбрионы мышей, фиксированные параформальдегидом, давали сильный общий контраст при окрашивании как IKI, так и PTA (рис. 9 и дополнительные файлы 4, 5, 6). Общая дифференциация тканей по крайней мере сравнима с дифференциацией, полученной при сушке до критической точки [33] или окрашивании осмием [15], хотя, возможно, не так хорошо, как на некоторых изображениях микроМРТ [34].
Рисунок 9Эмбрионы мыши . Слева: виртуальные срезы мыши Theiler stage 21, фиксированные параформальдегидом и окрашенные IKI. Размер вокселя 9,0 мкм. В центре: аналогичный эмбрион, окрашенный ПТА. Размер вокселя 9,6 мкм. Справа: эмбрион мыши 12,5 dpc, окрашенный осмием, залитый и отсканированный в смоле JB4 (стандартный препарат ТЕМ). Размер вокселя 8,2 мкм. Образец был подготовлен Р. Уолшем (Лаборатория медико-биологических наук, ЭМ Университета Пенсильвании), а микроКТ-сканирование было выполнено в 2001 году в клинике Мэйо в лаборатории доктора Ф.Эрик Ритман (Исследовательская лаборатория физиологической визуализации, Рочестер, Миннесота). Дополнительные файлы 4 и 5 представляют собой видеоролики в формате QuickTime этого эмбриона, окрашенного PTA, и эмбриона, окрашенного IKI стадии 22.
Ткани, окрашенные осмием, могут быть визуализированы с помощью микроКТ после погружения в смолу, как при срезании с помощью ПЭМ. На рисунке 9 (справа) показаны виртуальные срезы 12,5-дневного эмбриона мыши, окрашенного осмием, в JB4, отсканированные в 2001 году на внутреннем сканере в клинике Майо (Рочестер, Миннесота). Различия в уровнях поглощения между различными органами не так велики, как в образцах IKI и PTA, вероятно, частично из-за инфильтрованной смолы.Это открывает возможность получения изображений микро-КТ и ПЭМ с одним и тем же встроенным образцом, обеспечивая точную регистрацию ультраструктуры и количественных изображений всего объема.
На сегодняшний день четырехокись осмия является наиболее распространенным контрастным красителем для микроконтактной визуализации мягких тканей и является естественным кандидатом: осмий имеет энергию связи электронов, благоприятную для сильного поглощения рентгеновских лучей, он уже доступен во многих учреждениях и Осмий, как известно, связывается с клеточными мембранами и другими богатыми липидами структурами, включая нервы.Однако осмий очень токсичен, дорогостоящий в утилизации и плохо окрашивает, если образцы были в спирте. Его проникновение происходит медленно и может достигать верхнего предела у особей крупнее мышей в середине беременности [15, 27]. PTA также медленно проникает в ткани, но он гораздо менее токсичен, намного проще в использовании и эффективно окрашивает образцы, хранящиеся в спирте. Неорганический йод легко проникает во все мягкие ткани, протестированные на данный момент, и оказалось, что это универсальное и надежное контрастное пятно.
Насекомые
MicroCT уже становится популярным методом визуализации морфологии насекомых [35].Используемые в настоящее время методы контрастирования включают фазовый контраст [11], окрашивание осмием и другими тяжелыми металлами [16, 17, 36] и сушку до критической точки [37, 38]. Представленные здесь методы предлагают дополнительные возможности, особенно когда желательно сканировать образцы в жидкости или выделить различные подмножества тканей.
Окрашенные йодом насекомые, сканированные в спирте, демонстрируют детальную структуру как хитиновых, так и мягких тканей, сохраняя при этом свое естественное пространственное расположение (рис. 10). Мускулатура особенно ясна на изображениях насекомых, окрашенных I2E после фиксации Буэна: происхождение, направление и прикрепление каждой мышцы точно представлены, и такие изображения позволят количественно измерить поперечные сечения мышц и области прикрепления, а также предлагают возможность функционального моделирования.Окрашивание I2E также хорошо работало на насекомых, фиксированных только спиртом, хотя общее сохранение морфологии лучше при фиксации Буэна.
Рисунок 10Нейрокрылое насекомое (род Sisyra ) с мускулатурой и общей морфологией мягких тканей . Фиксируется в жидкости Буэна и окрашивается I2E, сканировано в этаноле. Виртуальные горизонтальные разрезы толщиной в один воксель (вверху) и объемные визуализации в разрезе (внизу). Мышцы особенно четко очерчены, а полное проникновение йода делает его более подходящим, чем PTA или осмий, для целых особей насекомых.Шкала 100 мкм. Образцы из Доминика Циммерманна, Музей естественной истории, Вена. Размер вокселя 4,3 мкм (голова + грудная клетка, слева), 2,0 мкм (голова, справа).
При исследовании органов чувств в ногах мантофазмид (продолжающееся сотрудничество с М. Эберхардом, Венский университет) было обнаружено, что окрашивание ПТА после фиксации спиртовым раствором Буэна дает более четкую дифференциацию мелкомасштабных структур, чем йод, на изображениях микроКТ (рис. 11). ). PTA не проникает в кутикулу, поэтому ноги насекомых нужно было обрезать до длины не более нескольких миллиметров, чтобы пятно могло проникнуть в интересующие ткани.Внутри сколопидиального органа можно увидеть отдельные сенсорные клетки и волокна, а также отдельные клетки крови и отдельные мышечные волокна.
Рис. 11Большеберцовая кость насекомого-мантофазмида (не описанный род), демонстрирующая чувствительный к вибрации сколопидиальный орган . Стереопара для сходящегося (косоглазого) просмотра. Фиксация Буэна / спирта, окрашивание ПТА. Необходимо было отрезать сегменты ноги длиной не более 3–4 мм, чтобы позволить РТА проникнуть насквозь. Диаметр ножки ок.300 мкм. Этот объемный рендеринг показывает сколопидиальный орган, и можно четко выделить отдельные сенсорные клетки и волокна, мышечные волокна и отдельные клетки крови. Хитин насекомых окрашивает ПТА сильнее, чем йод. Образец из Моники Эберхард, Univ. Вена. Размер вокселя 0,9 мкм.
Куколки насекомых
Алкогольный йод и ПТА были протестированы на куколках мух на разных стадиях в рамках продолжающегося исследования метаморфоза мясных мух (совместно с М. Форчер, Венский университет). Было обнаружено, что фиксация в горячем этаноле хорошо помогает сохранить морфологию куколки для окрашивания и визуализации.Адекватное окрашивание было получено только путем прокалывания или даже удаления пупария, чтобы позволить раствору красителя проникнуть, особенно при окрашивании PTA.
На рис. 12 показана куколка на поздней стадии (за день до вылупления) мясной мухи Calliphora (Diptera: Calliphoridae), окрашенной PTA. Окрашивание завершено, и морфология взрослого насекомого отчетливо видна. Из-за их размера — около 8 мм в длину — эти куколки были получены с помощью SkyScan 1174.
Рисунок 12Поздняя куколка мясной мухи Calliphora vicinia (Diptera) .Фиксируется горячим этанолом и окрашивается ЗТА. Куколки должны быть перфорированы для проникновения PTA. Вверху: объемный рендеринг с горизонтальным вырезом. Внизу: парасагиттальные и горизонтальные единичные реконструированные разрезы. Шкала шкалы: 1 мм. Образцы подготовлены и предоставлены Марлис Форчер, Univ. Вена. Сканирование SkyScan 1174, размер вокселя 7,7 мкм.
Другие беспозвоночные
Представленные здесь методы не являются видоспецифичными, и несколько других примеров показаны на рисунках 13, 14 и 15. Хвостовоябровидный моллюск из рода Falcidens был окрашен осмием и залит в смоле Spurr. стандартный метод для получения срезов и ПЭМ-изображений.На рис. 13 показаны изображения, полученные с помощью микро-КТ неповрежденного полимерного блока. Поскольку объемное изображение может быть виртуально повторно секционировано в любой произвольной плоскости, последующие изображения ПЭМ могут быть сопоставлены с их исходными местоположениями во всем образце и точно коррелированы с общей картиной животного.
Рисунок 13Хвостово-пальчатый моллюск ( Falcidens sp ) . Окрашено тетроксидом осмия и залито смолой Spurr для электронной микроскопии, отсканировано в блоке из смолы.Объемный рендеринг (слева) сканирования с низким разрешением, показывающий передние 1,4 мм животного. Визуализация объема в разрезе (в центре) и один восстановленный фрагмент (справа) сканирования того же блока с более высоким разрешением, показывающий область средней кишки. Это объемное изображение было обработано с помощью медианного фильтра (ядро 3 × 3). Масштабная линейка = 100 мкм. Размер вокселя 3,2 мкм (слева), 1,6 мкм (в центре и справа). Образец подготовлен и предоставлен Emanuel Redl, Univ. Вена.
Рис. 14Объемная визуализация пресноводных мшанок Cristatella mucedo , окрашенная PTA .Образец фиксировали в Буэна и окрашивали PTA. Проверено в спирте. Общая длина примерно 2 мм. Размер вокселя 4,2 мкм. Образец из Thomas Schwaha и Stephan Handschuh, Univ. Вена.
Рисунок 15Птенцы кальмаров, Ideosepius pygmeus , ок. Длина 2 мм . Фиксируется в глютеральдегиде, хранится в какодилатном буфере и окрашивается PTA (слева) и IKI (справа). На окрашивание IKI потребовалось менее одного часа. Размер вокселя 4,0 мкм (слева) и 4.4 мкм (справа). Образцы из Janek von Byern, Univ. Вена.
На Рисунке 14 объемные изображения пресноводной мшанки ( Cristatella mucedo ) показывают пространственные отношения между всеми структурами в образце с возможностью количественных измерений и извлечения признаков мягких тканей, важных для систематики [29].
Вылупившихся птенцов кальмаров на Фигуре 15 окрашивали PTA (слева) и IKI (справа) и сканировали в спирте. Эти два пятна дают несколько разные модели дифференциации тканей на рентгеновских изображениях, подчеркивая важность тестирования разных пятен на каждом новом типе образцов.Недавно Голдинг и др. [29, 30] использовали окрашивание фосфорномолибденовой кислотой (ФМА) для усиления контраста у брюхоногих моллюсков для сканирования методом микроКТ и сегментации одонтофоральных хрящей. Их результаты показывают, что использование PMA в качестве окраски для микроКТ может заслужить дальнейшего внимания.
Двухэнергетическая КТ для дифференциации острого внутричерепного кровоизлияния от контрастного окрашивания или кальцификации: метаанализ
- 1.
Parizel P, Makkat S, Van Miert E, Van Goethem J, van den Hauwe L, De Schepper A (2001) ) Внутричерепное кровоизлияние: принципы интерпретации КТ и МРТ.Eur Radiol 11 (9): 1770–1783. https://doi.org/10.1007/s003300000800
CAS Статья PubMed Google ученый
- 2.
Payabvash S, Qureshi MH, Khan SM, Khan M, Majidi S, Pawar S, Qureshi AI (2014) Дифференциация внутрипаренхиматозного кровоизлияния от экстравазации контрастного вещества на постпроцедурной неконтрастной компьютерной томографии у пациентов с острым ишемическим инсультом, проходящих эндоваскулярное лечение . Нейрорадиология 56 (9): 737–744. https://doi.org/10.1007 / s00234-014-1381-8
Артикул PubMed Google ученый
- 3.
Renú A, Amaro S, Laredo C, Román LS, Llull L, Lopez A, Urra X, Blasco J, Oleaga L, Chamorro Á (2015) Актуальность нарушения гематоэнцефалического барьера после эндоваскулярного лечения ишемии инсульт: двухэнергетическое компьютерно-томографическое исследование. Инсульт 46 (3): 673–679
Артикул Google ученый
- 4.
Fiorelli M, Bastianello S, von Kummer RD, Del Zoppo GJ, Larrue V, Lesaffre E, Ringleb AP, Lorenzano S, Manelfe C, Bozzao L (1999) Геморрагическая трансформация в течение 36 часов после инфаркта головного мозга: связь с ранним клиническим ухудшением и трехмесячный исход в когорте Европейского кооперативного исследования острого инсульта I (ECASS I). Ход 30 (11): 2280–2284
CAS Статья Google ученый
- 5.
Khatri P, Wechsler LR, Broderick JP (2007) Внутричерепное кровоизлияние, связанное с реваскуляризационной терапией.Ход 38 (2): 431–440
Артикул Google ученый
- 6.
Nute JL, Le Roux L, Chandler AG, Baladandayuthapani V, Schellingerhout D, Cody DD (2015) Дифференциация внутричерепного кровоизлияния и кальцификации с низким затуханием с использованием двухэнергетической компьютерной томографии в фантомной системе. Investig Radiol 50 (1): 9–16
CAS Статья Google ученый
- 7.
Макариу Э., Патсалидес А.Д. (2009) Внутричерепные кальцификации.Appl Radiol 38 (11): 48
Google ученый
- 8.
Chen W, Zhu W., Kovanlikaya I., Kovanlikaya A, Liu T, Wang S, Salustri C, Wang Y (2014) Внутричерепные кальцификации и кровоизлияния: характеристика с количественным картированием восприимчивости. Радиология 270 (2): 496–505
Статья Google ученый
- 9.
Морхард Д., Эртл Л., Гердсмайер-Петц В., Эртль-Вагнер Б., Шульте-Альтедорнебург Г. (2013) Двухэнергетическая КТ сразу после эндоваскулярного инсульта: прогностические последствия.Cardiovasc Intervent Radiol 37: 1–8. https://doi.org/10.1007/s00270-013-0804-y
Статья Google ученый
- 10.
Tijssen MP, Hofman PA, Stadler AA, van Zwam W., de Graaf R, van Oostenbrugge RJ, Klotz E, Wildberger JE, Postma AA (2014) Роль двухэнергетической КТ в различении кровоизлияния в мозг и контрастное вещество после механической реваскуляризации при остром ишемическом инсульте. Eur Radiol 24 (4): 834–840. https: // doi.org / 10.1007 / s00330-013-3073-x
CAS Статья PubMed Google ученый
- 11.
Bonatti M, Lombardo F, Zamboni GA, Vittadello F, Curro Dossi R, Bonetti B, Pozzi Mucelli R, Bonatti G (2018) Количественная оценка экстравазации йода на двухэнергетической КТ головного мозга, выполненной после механической тромбэктомии для острый ишемический инсульт может прогнозировать геморрагические осложнения. AJNR Am J Neuroradiol 39 (3): 441–447. https://doi.org/10.3174/ajnr.A5513
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
- 12.
Gupta R, Phan CM, Leidecker C, Brady TJ, Hirsch JA, Nogueira RG, Yoo AJ (2010) Оценка двухэнергетической КТ для дифференциации внутримозгового кровоизлияния от окрашивания йодированным контрастным материалом. Радиология 257 (1): 205–211. https://doi.org/10.1148/radiol.10091806
Статья PubMed Google ученый
- 13.
Phan CM, Yoo AJ, Hirsch JA, Nogueira RG, Gupta R (2012) Дифференциация кровотечения от йодированного контраста в различных внутричерепных компартментах с помощью двухэнергетической головной компьютерной томографии. AJNR Am J Neuroradiol 33 (6): 1088–1094. https://doi.org/10.3174/ajnr.A2909
CAS Статья PubMed Google ученый
- 14.
Watanabe Y, Tsukabe A, Kunitomi Y, Nishizawa M, Arisawa A, Tanaka H, Yoshiya K, Shimazu T, Tomiyama N (2014) Двухэнергетическая КТ для обнаружения увеличения контрастности или утечки в пределах высокой плотности гематомы у пациентов с внутричерепным кровотечением.Нейрорадиология 56 (4): 291–295. https://doi.org/10.1007/s00234-014-1333-3
Статья PubMed Google ученый
- 15.
Bodanapally UK, Dreizin D, Issa G, Archer-Arroyo KL, Sudini K, Fleiter TR (2017) Двухэнергетическая КТ для усиления субдуральных излитий, которые маскируются под субдуральные гематомы: диагностика с виртуально высокомонохроматическим (190 -keV) изображения. AJNR Am J Neuroradiol 38 (10): 1946–1952. https://doi.org/10.3174/ajnr.A5318
CAS Статья PubMed Google ученый
- 16.
Wiggins WF, Potter CA, Sodickson AD (2019) Двухэнергетическая КТ для дифференциации небольших очагов внутричерепного кровоизлияния от кальция. Радиология 1
. https://doi.org/10.1148/radiol.20191
- 17.
Hu R, Besheli LD, Young J, Wu M, Pomerantz S, Lev MH, Gupta R (2016) Двухэнергетическая головка CT позволяет точно отличить интрапаренхиматозное кровоизлияние от кальциноза у пациентов отделения неотложной помощи. Радиология 280 (1): 177–183. https://doi.org/10.1148/radiol.2015150877
Статья PubMed Google ученый
- 18.
Johnson TR (2012) Двухэнергетический CT: общие принципы. Am J Рентгенол 199 (5_приложение): S3 – S8
Артикул Google ученый
- 19.
Liberati A, Altman DG, Tetzlaff J, Mulrow C, Gotzsche PC, Ioannidis JP, Clarke M, Devereaux PJ, Kleijnen J, Moher D (2009) Заявление PRISMA для составления систематических обзоров и метаанализов исследования, оценивающие медицинские вмешательства: объяснение и уточнение. Ann Intern Med 151 (4): W65 – W94.https://doi.org/10.7326/0003-4819-151-4-200
0-00136 Статья PubMed Google ученый
- 20.
Whiting PF, Rutjes AW, Westwood ME, Mallett S, Deeks JJ, Reitsma JB, Leeflang MM, Sterne JA, Bossuyt PM (2011) QUADAS-2: обновленный инструмент для оценки качества исследований диагностической точности . Ann Intern Med 155 (8): 529–536
Статья Google ученый
- 21.
Хиггинс Дж. (2011) Кокрановское руководство по систематическим обзорам вмешательств. Версия 5.1. 0 [обновлено в марте 2011 г.]. Кокрановское сотрудничество. www.cochrane-handbook.org
- 22.
Девилле В.Л., Бантинкс Ф., Бутер Л.М., Монтори В.М., Де Вет ХК, Ван дер Виндт Д.А., Беземер П.Д. (2002) Проведение систематических обзоров диагностических исследований: дидактические рекомендации. BMC Med Res Methodol 2 (1): 9
Статья Google ученый
- 23.
Deeks JJ, Macaskill P, Irwig L (2005) Оценивалась эффективность тестов на смещение публикации и другие эффекты размера выборки в систематических обзорах точности диагностических тестов. J Clin Epidemiol 58 (9): 882–893
Статья Google ученый
- 24.
Эбаши Р., Огата А., Нишихара М., Иноуэ К., Йошиока Ф, Такасе Й, Масуока Дж., Якушиджи И., Ирие Х, Хара Х, Абэ Т. (2019) Значение смоделированных обычных изображений на двухэнергетической КТ после эндоваскулярного лечения ишемического инсульта.Журнал NeuroInterv Surg, 11 (9): 898–902. https://doi.org/10.1136/neurintsurg-2018-014486
Статья PubMed Google ученый
- 25.
Paciaroni M, Agnelli G, Corea F, Ageno W, Alberti A, Lanari A, Caso V, Micheli S, Bertolani L, Venti M (2008) Ранняя геморрагическая трансформация инфаркта головного мозга: частота, прогностические факторы, и влияние на клинический исход: результаты проспективного многоцентрового исследования. Stroke 39 (8): 2249–2256
Артикул Google ученый
- 26.
Gn S, Cangür H, Albers T, Burgemeister A, Meyer-Wiethe K (2009) Сонографическая оценка геморрагической трансформации и артериальной реканализации при остром полушарном ишемическом инсульте. Ход 40 (1): 119–123
Артикул Google ученый
- 27.
Hamann GF, del Zoppo GJ, von Kummer R (1999) Геморрагическая трансформация инфаркта мозга — возможные механизмы. Thromb Haemost 82 (S 01): 92–94
Артикул Google ученый
Химическое окрашивание твердых частиц органического вещества для улучшения контраста на рентгеновских снимках почвы µCT
Окрашивание ПОМ в присутствии мелкого песка и крупного ила
По сравнению с неокрашенным контролем (среднее пиковое значение серого неокрашенного образца ± стандартное отклонение: 3686 ± 1557), все процедуры окрашивания вызывали небольшой сдвиг центрального пика значения серого вправо в сторону 3757 ± 1272 и 4421 ± 1646 для обработок PMA и PbAc, соответственно.Этот центральный пик представляет ослабление рентгеновского излучения крупными илами и ПОМ (рис. 2а). Однако на реконструированных КТ-разрезах повышенного ослабления рентгеновского излучения в крупнозернистом иле не наблюдалось (рис. 3). Вместо этого распределение значений серого для точечных частиц ПОМ (рис. 3) подтвердило, что окрашивание действительно вызвало явный сдвиг в значениях серого ПОМ, а именно. от 1000–4000 до 6000–18000. Это усиление контраста POM было более интенсивным для обработок AgNO 3 , PbAc и Pb (NO 3 ) 2 по сравнению с PMA (рис.3) и вызвали очень четкое увеличение правого хвоста гистограммы (значения серого> 7500), которое отсутствовало при обработке PMA (рис. 2a). Окрашивание Pb 2+ или Ag + также привело к появлению широких пиков значений серого POM, которые перекрывали пики крупного ила (диапазон значений серого: 2500–5000) и мелких частиц песка (диапазон значений серого: 5000–7500). , представленный вторым и третьим пиками на гистограммах валовой почвы (рис. 2а). Однако максимумы пиков гистограммы частиц ПОМ, окрашенных AgNO 3 (11,118), PbAc (13829), Pb (NO 3 ) 2 (14,255) и PMA (9678) (рис.3) явно превышает диапазон значений серого как для крупного ила, так и для мелкого песка, что позволяет предположить, что выделение ПОМ из этих минеральных фракций на основе значения серого по КТ должно быть возможным. Меньший сдвиг пика на гистограммах POM для PMA (рис. 3) показывает, что PMA был менее эффективен в увеличении ослабления POM, и это может быть приписано более низкой атомной массе (AM) Mo (95,9) по сравнению с Pb (207,2). . Точно так же эффект Ag (AM 107.9) был ближе к действию Mo. Помимо атомной массы, сродство к связыванию с OM, вероятно, также различается между контрастными веществами.В то время как Ag + и Pb 2+ связываются с органическими функциональными группами ПОМ через ионные связи, известно, что ПМА взаимодействует с сопряженными ненасыщенными связями 37 .
Рис. 2Гистограмма шкалы серого (0–16000) для 16-битных изображений ( a ) образцов мелкого песка + крупного ила + почвенного POM, ( b ) смесей мелкого песка + мелкого ила + POM и ( c ) смеси мелкий песок + глина + ПОМ. Неокрашенный контрольный образец (черный) и окрашенный AgNO 3 (красный), PbAc (синий), Pb (NO 3 ) 2 (фиолетовый) и PMA (зеленый).( d ) Гистограмма шкалы серого (0–16 000) для 16-битных изображений OsO 4 окрашенный мелкий песок + крупный ил + POM (fSa + cSi + POM; красный), мелкий песок + мелкий ил + POM (fSa + смеси fSi + POM; синий) и мелкий песок + глина + POM (fSa + C + POM; черный). Эквивалентные контрольные обработки обозначены пунктирными линиями. 3 (красный), PbAc (синий), Pb (NO 3 ) 2 (фиолетовый) и PMA (зеленый).Для каждой обработки включено двухмерное изображение в градациях серого, представляющее сегмент горизонтального среза смесей мелкий песок + крупный ил + ПОМ (контраст изображения на этом рисунке увеличен). Неокрашенные частицы ПОМ в контрольной обработке и окрашенные частицы ПОМ в обработках AgNO 3 , PbAc, Pb (NO 3 ) 2 и ФМА показаны красными стрелками.
Не было сдвига в сторону более высоких значений серого в третьем пике гистограмм керна почвы, представляющем мелкий песок (рис.2а). Кроме того, мы не обнаружили следов Pb, Ag или Mo ни на каких частицах мелкого песка или крупного ила, сканированных с помощью SEM – EDX (дополнительный рис. S1). Визуальный осмотр горизонтальных реконструированных срезов показал четкое различие окрашенных частиц ПОМ и минеральной фазы почвы. Сканирование SEM – EDX подтвердило наличие значительных EDX-пиков Mo, Pb или Ag на случайно выбранных частицах ПОМ, что напрямую подтвердило успешное избирательное окрашивание ПОМ всеми агентами (дополнительный рисунок S1). Более мелкие пятна минералов на поверхности ПОМ были видны на СЭМ-изображениях (дополнительный рис.S2), но наш анализ показывает, что они не ответственны за окрашивание ПОМ Mo, Pb или Ag. Окрашенный ПОМ можно также отличить от нескольких других частиц с высокой плотностью, таких как глауконит, поскольку последний не только характеризовался более высокими значениями серого 32 , но также и другим типом оттенков серого. Кроме того, в спектрах SEM – EDX некоторых плотных минеральных частиц обнаружены пики Zr, что позволяет предположить, что это ZrO 2 или силикат Zr. В заключение, эксперимент демонстрирует, что Pb (NO 3 ) 2 , AgNO 3 и PbAc способны избирательно связываться с ПОМ в смесях мелкого песка и крупного ила.Однако возможность повышения контраста ПОМ в таких почвенных смесях при обработке ПМА меньше.
Окрашивание ПОМ в присутствии мелкодисперсного ила и глины
ПМА, по-видимому, не окрашивает мелкий ил, без сдвигов пиков на гистограмме общей массы почвы (рис. 2В), не наблюдается видимого влияния на контраст минеральной фазы почвы ( Дополнительный рис. S3), и снова нет заметных пиков Mo в спектрах SEM – EDX минеральных частиц (дополнительный рисунок S4 и дополнительный рисунок S5). Напротив, AgNO 3 , PbAc и Pb (NO 3 ) 2 оказались довольно неселективными для ПОМ (рис.2Б). Действительно, окрашивание увеличивало серые значения пиков гистограммы, соответствующих тонкому илу (рис. 2b), что можно увидеть по смещению пиков гистограммы мелкого ила от серого значения 4303 к 4702–5577. Увеличение значений серого тонкого ила после окрашивания даже привело к частичному (Pb (NO 3 ) 2 и AgNO 3 ) или полному (PbAc) перекрытию с пиком гистограммы фракции песка. Правый хвост гистограммы значений серого также был значительно увеличен при обработке Pb (NO 3 ) 2 , AgNO 3 и PbAc и все больше перекрывался с диапазоном значений серого окрашенного POM (6000–18 000) (рис.3). Это перекрытие явно было результатом окрашивания мелкодисперсного ила, что также было очевидно на CT-срезах (дополнительный рис. S3). Сдвиг значений серого цвета гистограммы после окрашивания в смесях мелкий песок + глина был аналогичен таковому в смесях песок + мелкий ил, но с большим сдвигом в правом хвосте гистограмм Pb 2+ и Ag + до значений серого от 7500 до> 12000 (рис. 2c). Однако мы не обнаружили пиков EDX Pb или Ag на точечных мелких частицах ила или глины (дополнительный рис.S4). Но поскольку проверка CT-срезов (рис. 4) показала, что большие участки смесей были окрашены AgNO 3 , PbAc и Pb (NO 3 ) 2 , вполне возможно, что такие дискретные окрашенные области были по совпадению не использовались в нашем вспомогательном бессистемном SEM-анализе подвыборок. Несмотря на это, перекрытие диапазонов значений серого Pb 2+ и Ag + окрашенных POM и окрашенных частиц глины явно препятствует правильной сегментации обеих фаз. Как и в случае с мелкодисперсным илом, обработка ФМА не вызывала сдвига пиков гистограммы минеральных частиц (рис.2в) и не наблюдалось видимого влияния на затухание минеральной фазы в ГТ-разрезах (рис. 4). Это также предполагает, что Мо имеет более высокий потенциал связывания только с ОВ, чем Pb 2+ и Ag + , а не с минеральными поверхностями. Действительно, это может быть результатом нейтрального Mo (VI) O 3 в ПМА, в то время как катионы Pb 2+ и Ag + могут адсорбироваться на отрицательно заряженных минеральных поверхностях. Однако Chenu and Plante 24 не обнаружили никакой сорбции Pb и Ag на чистых глинистых минералах (вермикулит, иллит, каолинит).Несмотря на то, что минералы, идентифицированные в нашей глинистой фракции, являются каолинитом и смектитом, могла произойти сорбция Pb (по наблюдениям Чену и Планте 24 ) или Ag на оксидах и гидроксидах Al и Fe в глинистой фракции.
Рисунок 4Двухмерное изображение в шкале серого, представляющее горизонтальный срез смесей мелкого песка + глины + ПОМ: контрольная обработка и окрашенный AgNO 3 , PbAc, Pb (NO 3 ) 2 и PMA обработки (контраст изображения на этом рисунке увеличен).Кластеры окрашенных частиц глины отчетливо видны как более яркие структуры при обработке AgNO 3 , PbAc и Pb (NO 3 ) 2 .
Хотя ручное точечное наведение POM, окрашенного PMA, не было затруднено, автоматическое извлечение POM из объема CT все еще может оказаться сложной задачей из-за отсутствия контраста изображения между POM и частицами минеральной почвы. Самая последняя работа Lammel et al. 38 применил инструмент сегментации машинного обучения в объемах компьютерной томографии почвы на основе синхротрона, но добился ограниченного успеха.Piccoli et al. 39 предположил, что способность оператора выбирать пороговые значения может по-прежнему приводить к наиболее точной сегментации РОМ в почве.
Влияние на структуру образца
Оценка гистограммы объемной пробы (рис. 2a) образцов мелкого песка + крупного ила показала, что пик значения серого порового пространства (средний пик серого значения неокрашенного образца ± стандартное отклонение: 1765 ± 609) немного сдвинулись после окрашивания Pb (NO 3 ) 2 (1930 ± 386), AgNO 3 (1923 ± 392) и PbAc (2204 ± 314) и в меньшей степени PMA (1801 ± 611). ).Также наблюдалось уменьшение высоты пика порового пространства для обработок, окрашенных Pb (NO 3 ) 2 , AgNO 3 и PbAc, на 16%, 27% и 42% соответственно. При обработке PbAc пик порового пространства почти полностью исчез, тогда как это падение было меньше для AgNO 3 и намного меньше для Pb (NO 3 ) 2 . Напротив, в образцах, окрашенных ФМА, такого уменьшения пика порового пространства не наблюдалось. Уменьшение объема пор (рис. 5) для обработки Pb (NO 3 ) 2 , AgNO 3 и PbAc соответствовало тенденции к уменьшению высоты пика пор.Кроме того, противоположные тенденции увеличения высоты пика наблюдались для второго пика крупного ила (+ 6%, 13%, 25% соответственно) и третьего пика мелкого песка (+ 18%, 19% и 33%, соответственно). ). В совокупности эти наблюдения демонстрируют, что наблюдаемые изменения в поровом пространстве и площадях пиков минеральной фазы являются результатом уплотнения образцов обработкой Pb (NO 3 ) 2 , AgNO 3 и PbAc.
Рисунок 5Общая видимая пористость µCT на рентгеновских снимках в смесях мелкого песка + крупного ила + POM: неокрашенный контрольный образец (черный) и окрашенный AgNO 3 (красный), PbAc (синий), Pb (NO 3 ) 2 (фиолетовый) и PMA (зеленый).
Учитывая, что уменьшение высоты пиков сильно различается для Pb (NO 3 ) 2 и PbAc, ухудшение структуры почвы не может быть связано исключительно с нанесенным тяжелым элементом (оба содержат Pb 2+ ). Кроме того, меньшая пористость вряд ли была вызвана преимущественно добавлением NO 3 —, поскольку добавление Pb (NO 3 ) 2 повлияло бы на структуру в большей степени, чем AgNO . 3 , который содержит меньше (0.5 ×) NO 3 — (все растворы были при 1 M). Следовательно, ухудшение структуры образца, скорее всего, было физическим явлением. Один из возможных механизмов мог заключаться в том, что повышенное разрежение в результате перфузии более вязкого агента могло более серьезно нарушить структуру почвенных смесей. Однако возрастающая степень деформации структуры не может быть связана с более высокой вязкостью окрашивающих растворов (рассматривается при 0,01 или 0,1 М 40,41,42 ).Следовательно, результаты этого исследования не позволили установить точное происхождение этого артефакта. Как следствие, следует соблюдать осторожность при перфузии образцов почвы жидкими красящими веществами, поскольку ухудшение структуры почвы также изменит пространственное расположение ПОМ. Таким образом, эти результаты показывают, что проверка структуры почвы по-прежнему требуется до тех пор, пока не будет определена конкретная причина ухудшения.
Гистограммы обработки Pb (NO 3 ) 2 , AgNO 3 и PbAc как для мелкодисперсного ила (рис.2b) и смеси глины (рис. 2c) также имели более мелкий и более широкий пик порового пространства. Вероятно, что и то, и другое связано с повышенным проявлением эффектов частичного объема (PVE) из-за химического окрашивания. Считается, что уплотнение после окрашивания привело к большему количеству вокселей, содержащих как поровое пространство, так и минеральные частицы. При разрешении вокселей 7 мкм это увеличивало количество вокселей порового пространства с промежуточным значением серого (2000–4000). Порядок увеличения значения серого для образцов тонкого ила и глины был аналогичен таковому для смесей крупного ила: PbAc> Pb (NO 3 ) 2 > AgNO 3. Химическое окрашивание оказывало все более сильное влияние на ослабление рентгеновских лучей в поровом пространстве для смесей с более мелкими частицами, вероятно, из-за более интенсивного связывания Ag + и Pb 2+ на их гораздо более крупных реактивных поверхностях.
В этом исследовании сочетание структурной деградации и перекрытия диапазонов значений серого POM и минеральных фракций делает эти красящие вещества непригодными для окрашивания естественных почв. Однако дальнейшая разработка и тестирование метода окрашивания может свести к минимуму воздействие на структуру почвы.Образцы ила и глины, обработанные PMA, не подверглись структурной деструкции, и никаких нежелательных сдвигов диапазонов значений серого цвета минеральных частиц не наблюдалось. Однако образцы искусственной почвы не полностью репрезентативны для почвы с естественной структурой, и дальнейшие испытания могут также исключить деградацию естественной структуры почвы за счет перфузии растворами ПМА. Мы ожидаем, что структурная целостность образцов естественного грунта будет превосходить целостность «рыхлых» почвенных смесей, испытанных в данной работе.
Производительность PMA по сравнению с газообразным OsO
4 окрашиваниеПроверка горизонтальных КТ-срезов показала, что OsO 4 (дополнительный рис.S6a – c) не увеличивало ослабление рентгеновского излучения минеральным материалом. Об этом также свидетельствует отсутствие сдвига влево пиков минеральных фракций (серое значение 2500–7000) после обработки OsO 4 (рис. 2d).
Распределение значений серого, полученное путем ручного точного наведения частиц ПОМ, показало, что интервал значений серого ПОМ, окрашенного OsO 4 (рис. 6), соответствует правому хвосту гистограмм почвенной смеси. Этот эффект был больше, но все же сравним со сдвигом значения серого POM, полученным при обработке PMA.Этот результат является вероятным результатом того, что оба окрашивающих агента нацелены на ненасыщенные связи, например, в углеводороды или белки, а также более высокая атомная масса Os (190,2) по сравнению с Mo (95,9). Из-за значительного риска для здоровья при использовании OsO 4 PMA представляется подходящей альтернативой. Увеличение значений серого POM после окрашивания как PMA, так и OsO 4 показало достаточную дифференциацию частиц POM от минеральной фракции, по крайней мере, для точного наведения вручную. Однако сегментирование на основе одного порога PMA- или OsO 4 -окрашенного POM в объемах рентгеновской компьютерной томографии, полученных с помощью этой лабораторной полихроматической рентгеновской µCT-системы, оказалось невозможным.Требуются более сложные алгоритмы сегментации, как совсем недавно было предложено Piccoli et al. 39 . Мы предлагаем разработать алгоритмы самообучения (например, включить машинное обучение), которые учитывают локальные паттерны значений серого POM в сочетании с морфологическими характеристиками для более объективной и быстрой сегментации окрашенного POM. При использовании самообучающихся алгоритмов вмешательство экспертов для сегментации частиц POM будет сведено к абсолютному минимуму и со временем уменьшится.Кроме того, технологические разработки, скорее всего, еще больше улучшат разрешение рентгеновской компьютерной томографии, что значительно улучшит морфологические характеристики более мелкозернистого ПОМ.
Рис. 6Гистограмма шкалы серого (0–25 000) для точечных частиц ПОМ на 16-битных изображениях смесей мелкодисперсного песка + глины + ПОМ, окрашенных PMA (зеленый) или OsO 4 (черный).
В качестве альтернативы наличие K-края в спектре поглощения рентгеновских лучей молибдена может быть использовано для различения ПОМ на КТ-изображениях.Rawlins et al. 33 и Peth et al. 31 ранее успешно использовали появление K-края в спектре поглощения рентгеновских лучей Os при сканировании почвы с помощью синхротрона µCT при энергиях фотонов непосредственно ниже и выше K-края. Однако K-край Mo расположен на уровне 20 кэВ, уровне энергии, на котором большая часть рентгеновских лучей может ослабляться фракцией минералов почвы, что, вероятно, делает подход с двойной энергией, аналогичный тому, который используется для Os, затрудняющим использование несинхротронных систем. сканеры и, вероятно, также для синхротронов.Совсем недавно Ламмель и др. 38 идентифицировал газообразный йодид (I 2 ) как вероятного кандидата для избирательного окрашивания ОВ в почве для использования с синхротронными сканерами.